Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Migration von Gliazellen in den Entwicklungsländern Drosophila Auge mit Live-mikroskopische Analyse mit GFP markierten Gliazellen gepaart untersuchen.
Abstract
Gliazellen der Wirbeltiere und wirbellose Organismen müssen Endziel Regionen wandern, um umhüllen und Unterstützung verbunden Neuronen. Während die jüngsten Fortschritte gemacht worden, um die Live-Migration von Gliazellen in den Entwicklungsländern Puppenstadium Flügel (1), Studium der Beschreibung
Protocol
Teil 1: Pre-Versuchsanordnung.
- Eine Woche im Voraus, fliegt Kumpel zur Larve zu generieren, die ausdrückliche GFP unter der Kontrolle eines Glia-spezifischen Promotors. Für unser Experiment haben wir visualisiert GFP mit einem Kernlokalisierungssequenz in Gliazellen mit umgekehrter Polarität (Repo)-Promotor (3, 4) zum Ausdruck markiert.
- Bereiten Deckgläser mindestens einen Tag im Voraus durch Einweichen 18 mm runde Deckgläser für 10 Minuten in 1% Poly-L-Lysin-Lösung und in der Luft über Nacht trocknen.
- Am Tag vor dem Experiment, sauber ein Chamlide magnetischen Kultur Kammer durch Einweichen über Nacht Komponenten in 70% Ethanol.
- Am Tag des Experiments, bereiten Kulturmedium durch Zugabe von fötalem Rinderserum, Penicillin-Streptomycin-Lösung und Insulin zu 10 ml Insektenmedium Schneider unter aseptischen Bedingungen. Die Arbeitsgruppe Konzentrationen sind: 1X Rinderfötenserum; 100U/ml Penicillin; 0.1mg/ml Streptomycin und 0,2 mg / ml Insulin in Insektenmedium Schneider (modifiziert nach (5)).
- Lassen Sie die Kultur Kammer an der Luft in einer Zellkultur Haube trocknen. Abwaschen Restethanol aus dem Kulturraum durch Spülen mit vorbereiteten Kulturmedium.
Teil 2: Präparation des Drosophila Auge-Gehirn-Komplex.
- Wählen Sie einen dritten Larvenstadium wandernde Larven von der Seite eine Fliege Fläschchen und in einen Tropfen gekühlt Kulturmedium auf eine Petrischale auf Eis für mehrere Minuten. Chilling die Larve wird empfohlen, peristaltische Kontraktionen Körper für eine einfache Zerlegung langsam.
- Legen Sie die gekühlte Larve in einen Tropfen Kulturmedium auf einem Sylgard beschichtet Gericht unter einem Dissektionsmikroskop.
- Unter dem Dissektionsmikroskop, verwenden Sie ein Paar Dumont feinen Pinzette fest zu greifen die Larve etwa ein Drittel des Weges aus dem hinteren Ende. Warten Sie, bis die Larve dringt in ihren Mund Haken aus dem vorderen Ende. Fassen Sie den Mund Haken mit einer zweiten Pinzette auf volle Streckung. Um sezieren die Larve, langsam ziehen die zwei Pinzetten in entgegengesetzte Richtungen. Die Auge-Gehirn-Komplex, zusammen mit Speicheldrüsen, Fettkörper und imaginalen Gewebe, wird wegziehen aus dem larvalen Körper. Ziehen Sie nicht den Mund Haken zu schnell sonst werden sie abreißen des Auge-Gehirn-Komplex.
- Trim entfernt Speicheldrüsen, Fettkörper und Imaginalscheiben mit ultrafeinen clipper Schere. Die beiden Hemisphären des Gehirns und der Augen-Discs, die Bauchmark und Mund Haken befestigt werden.
- Ein 18 mm Deckglas auf einen Objektträger. Lassen Sie einen Rand des Deckglases hängen über den Rand der Folie, um später abholen Deckglas. Fügen Sie einen Tropfen Kulturmedium auf die 18 mm Deckglas. Übertragen Sie die Auge-Gehirn-Komplex in das Kulturmedium durch Erfassen des Mundhaken mit einer Pinzette. Greifen Sie nicht die Auge-Gehirn-Komplex direkt mit der Pinzette oder das Gewebe beschädigt wird.
- Mit feinen Sezierung Schere, schneiden Sie den Mund Haken aus dem Auge-Hirn-komplex und zu verwerfen. Entfernung von der Mündung Haken ist für Live-Bildgebung wichtig wie die Mundhaken wird weiterhin in das Kulturmedium wodurch das Gewebe während der Mikroskopie zu bewegen Vertrag.
- Um glialen Migration innerhalb des Auges Imaginalscheibe visualisieren, sorgfältig schneiden die optische Stengel, die dünnen Gewebe, Gehirn und Auge Scheibe verbindet und wegzuschieben oder zu verwerfen das Gehirn (siehe Abbildung 1A). Zur Visualisierung Glia innerhalb der optischen Stiel, verlassen das Gehirn, Optik Stiel und Auge Imaginalscheibe intakt (siehe Abbildung 1E).
- Pick-up das Deckglas mit einer Pinzette und ziehen Sie einen Kreis unter der ganzen Gewebe von Interesse mit einem Permanent-Marker. Dieser Kreis wird bei der Ortung des Gewebes für die Mikroskopie in Teil 4 zu unterstützen.
Teil 3: Anschluss des Auges Imaginalscheibe in einem magnetischen Kultur Kammer.
- Mit einer Pinzette fassen Sie den hängenden Rand des Deckglases. Übertragen Sie die Deckglas auf die Bodenplatte des Chamlide magnetische Kammer, ohne die Gewebe in der Kultur.
- Setzen Sie den Silikon-O-Ring auf den Hauptteil der Chamlide Kammer. Installieren Sie den Hauptteil auf der Bodenplatte.
- Langsam Kulturmedium in die Kammer. Fügen Sie nicht das Kulturmedium zu schnell oder das Gewebe von Interesse gestört werden. Nicht vollständig füllen die Kammer für den Gasaustausch unter dem Deckmantel ermöglichen.
- Sanft statt der unsichtbaren Abdeckung auf der Oberseite des Chamlide Kammer.
Teil 4: Visualisierung der Migration Gliazellen im Auge CD.
- Legen Sie die Kultur Kammer auf der Bühne eines konfokalen oder Fluoreszenzmikroskop. Suchen Sie das Beispiel mithilfe der Kreis auf dem Deckglas als Referenz auf geringer Vergrößerung.
- Konzentrieren Sie sich auf der Probe mit einem 40x Objektiv. Lassen Sie das Gewebe auf das Deckglas zu begleichen. Machen Sie Bilder des Auges Disc oder optischen Stiel jede 10-15min über 3-4 Stunden. Das Gewebe kann zucken und bewegen out of focus. Manuelles Fokussieren des Gewebes vor der Aufnahme von Bildern wird zu lindern thist Problem.
Teil 5: Repräsentative Ergebnisse:
Korrekt ausgeführt, erlaubt unser Protokoll wir eine Reihe von Bildern von GFP-markierten Gliazellen, die von der Optik Stiel ins Auge Imaginalscheibe (Abbildung 1 BD) migriert zu sammeln. Während Live-Bildgebung für eine 60-Minuten-Zeitraum war ausreichend, um Veränderungen in den Positionen der Glia-Kerne in einem Wildtyp-Auge Imaginalscheibe beobachten Gliazellen Kerne in einer Mutante für ein Gen, die für Gliazellen Migration völlig versäumt, die Optik Stiel (Pfeile Ausfahrt Abbildung 1 FH).
Wir haben kultivierten Auge-Hirn-Komplexe für die Zeiträume, solange 240 Minuten vor Beobachtung Verschlechterung der gezüchtetes Gewebe. Nach dem 240-Minuten-Punkt fangen wir an, GFP-positiven Zellen in das Kulturmedium umliegenden kultivierten Auge-Gehirn-Komplexe (Pfeil Abbildung 2 C) zu beobachten. Darüber hinaus GFP wird in diffuse Flecken in den Geweben was auf einen Abbau im Gewebe Integrität zu akkumulieren.
Abbildung 1: Live Darstellung von GFP-markierten Gliazellen Kerne in den Entwicklungsländern Wildtyp und Mutante visuellen Systemen.
A, E) aufgenommene Bilder mit Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Mikroskopie von kultivierten Wildtyp und Mutante eye-Imaginalscheiben (ED). Im Wildtyp sind Gliazellen in geboren und wandern von der Optik Stiel (OS) in das Auge-Disc. Das Gehirn wurde entfernt, um Abflachung und Bildgebung des Auges Imaginalscheibe erleichtern. BD) Fluoreszenzmikroskopie des Wildtyp-kultivierten Auge Imaginalscheibe in (A) bei 0, zeigt 30, und 60 Minuten Zeitpunkten GFP-markierten Gliazellen Kerne innerhalb des Auges Scheibe wandern.
FH) Fluoreszenzmikroskopie des mutierten Auge-Gehirn-Komplex in (E) bei 0, zeigt, 30 und 60 Minuten Zeit, die Punkte a Abwürgen des GFP-markierten Gliazellen Kerne innerhalb der optischen Stiel (Pfeil). Das Gehirn (BR) wurde links an der Optik Stengel Bildgebung von Glia innerhalb der Stiel zu erleichtern.
Abbildung 2: Live Darstellung von GFP-markierten Gliazellen Membranen in einem Wildtyp-Auge Imaginalscheibe. Wir haben erfolgreich Auge-Hirn-Komplexe für die 240-Minuten-Perioden kultiviert. Tissue kultivierten länger als 240 Minuten beginnt zu bröckeln. Das Kulturmedium rund um das Auge Imaginalscheibe (ED), Optik Stiel (OS), und das Gehirn Lappen (BR) auf 0 (A) und 150 Minuten (B), im Vergleich zu den 300 Minuten Zeit-Punkt (C), ist frei der GFP-positiven Zellen, die durch einen Pfeil.
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir Beobachtung von Gliazellen Migration in das Auge Imaginalscheibe mit Live-Mikroskopie. In unserem Wildtyp Beispiel (Abbildung 1 AD), verwendeten wir eine nukleare GFP Marker Gliazellen Bewegung in die Augen zu beobachten Disc im Laufe von einer Stunde. In einer Mutante für einen Kandidaten-Gen für Gliazellen Migration derzeit untersucht in unserem Labor erforderlich, beobachteten wir einen Stillstand der Glia-Zellkernen in der Optik Stiel während eines Zeitraums von einer Stunde (Abbildung 1 EH). Unsere Strategie angepasst, um weitere Details der zellulären Verhaltens von unseren Gen von Interesse reguliert zu visualisieren. Zum Beispiel eine Membran GFP-Molekül gezielt, wie mCD8-GFP, können in Glia, um zelluläre Prozesse sichtbar zum Ausdruck gebracht werden. Die Verwendung einer Membran-gebundene GFP-Marker wird uns erlauben, festzustellen, ob Gliazellen in unserer Mutanten in der Lage zu verlängern zellulären Prozessen wie Filopodien in das Auge Disc sind. Ebenso Aktin mit GFP oder Tubulin mit GFP markiert markiert könnte in den Entwicklungsländern Gliazellen exprimiert werden, um Veränderungen im Zytoskelett während Gliazellen Migration zu visualisieren. Darüber hinaus kann die Untersuchung einzelner GFP-markierten Mutanten Gliazellen visualisiert werden mit Live-Mikroskopie (6). Diese Technik erlaubt es uns, genauer zu beschreiben die Voraussetzung für unsere Gen von Interesse bei der Regulierung der Migration von Gliazellen.
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Acknowledgments
Patrick Cafferty wird durch ein Postdoc-Stipendium von der Multiple Sclerosis Society of Canada unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
