Summary
Qui descriviamo un protocollo per esaminare la migrazione delle cellule gliali in un occhio lo sviluppo di Drosophila mediante l'analisi microscopica vivono in coppia con tag GFP cellule gliali.
Abstract
Cellule gliali di entrambi gli organismi vertebrati e invertebrati devono migrare verso le regioni obiettivo finale per ensheath e supportare i neuroni associati. Anche se i recenti progressi sono stati fatti per descrivere la migrazione live delle cellule gliali nell'ala sviluppo pupale (1), gli studi di
Protocol
Parte 1: Pre-set-up sperimentale.
- Una settimana di anticipo, compagno vola a generare larva che esprimono GFP sotto il controllo di un gliali specifico promotore. Per il nostro esperimento abbiamo visualizzato GFP taggati con una sequenza di localizzazione nucleare espressi nelle cellule gliali con la polarità invertita (pronti contro termine) promotore (3, 4).
- Preparare copertura scivola almeno un giorno di anticipo da una immersione 18 millimetri coprioggetto tondo per 10 minuti in 1% di poli-L-lisina soluzione e aria secca durante la notte.
- Il giorno prima dell'esperimento, pulire una camera Chamlide cultura magnetico immergendo i componenti durante la notte nel 70% di etanolo.
- Il giorno dell'esperimento, preparare un terreno di coltura con l'aggiunta di siero fetale bovino, penicillina-streptomicina soluzione, e l'insulina a 10 ml di terreno insetti Schneider con tecnica asettica. Le concentrazioni di lavoro sono: 1X siero fetale bovino; 100U/ml penicillina, streptomicina 0.1mg/ml e 0,2 mg / ml di insulina nel medio insetti Schneider (modificato da (5)).
- Lasciare che la camera di cultura ad asciugare in una cappa di coltura cellulare. Lavare etanolo residua dalla camera di cultura lavando con terreno di coltura preparato.
Parte 2: Preparazione del occhio-cervello complesso Drosophila.
- Selezionare un terzo instar larva errante dal lato di una fiala mosca e posto in una goccia di terreno di coltura fresco su una piastra di Petri in ghiaccio per diversi minuti. Agghiacciante la larva si consiglia di rallentare le contrazioni peristaltiche del corpo per facilitare la dissezione.
- Posizionare la larva raffreddato in una goccia di terreno di coltura su un piatto rivestito Sylgard al microscopio di dissezione.
- Sotto il microscopio dissezione, usare un paio di pinze Dumont fine per afferrare saldamente la larva circa un terzo della distanza dalla fine posteriore. Attendere che la larva estrude la sua bocca ganci a partire dalla fine anteriore. Afferrare la bocca ganci con un secondo paio di pinze sulla piena estensione. A sezionare la larva, tirare lentamente le due coppie di pinze in direzioni opposte. L'occhio-cervello complesso, insieme con le ghiandole salivari, corpi grassi, e il tessuto immaginale, tirerà fuori dal corpo larvale. Non tirare la bocca ganci troppo in fretta altrimenti si strappano l'occhio-cervello complesso.
- Troncare ghiandole salivari, corpi grassi, e dischi immaginale ultra-sottile forbici clipper. I due emisferi del cervello e degli occhi-dischi sarà attaccato al cordone nervoso ventrale e ganci bocca.
- Inserire un vetrino 18 mm su un vetrino. Lasciare un bordo del vetrino appeso fuori dal bordo della diapositiva in modo da raccogliere dopo il vetrino. Aggiungere una goccia di terreno di coltura sul slittamento 18 millimetri di copertura. Trasferire la occhio-cervello complesso nel terreno di coltura afferrando i ganci bocca con una pinza. Non cogliere l'occhio-cervello complesso direttamente con il forcipe o il tessuto sarà danneggiato.
- Dissezione con forbici bene, tagliare la bocca ganci da occhio-cervello complesso e scartare. La rimozione dei ganci bocca è importante per l'imaging vivere come i ganci bocca continuerà a contrarsi nel terreno di coltura che causa il tessuto di muoversi durante la microscopia.
- Per visualizzare la migrazione gliale all'interno del disco occhio immaginale, accuratamente tagliato il gambo ottica, il tessuto sottile che collega il cervello e il disco occhi e allontanare o scartare il cervello (vedi figura 1A). Per visualizzare glia all'interno del fusto ottica, lasciare il cervello, gambo di ottica, e il disco immaginale occhio intatto (vedi figura 1E).
- Sollevare il coprioggetto con pinze e disegnare un cerchio intorno sotto il tessuto di interesse con un pennarello indelebile. Questo cerchio aiuterà a localizzare il tessuto per microscopia nella parte 4.
Parte 3: Montaggio del disco immaginale occhio in una camera di cultura magnetico.
- Utilizzando pinze, afferrare il bordo impiccagione del vetrino. Trasferire il vetrino per la piastra inferiore della camera di Chamlide magnetico senza disturbare il tessuto in coltura.
- Mettere il silicone O-ring sul corpo principale della camera Chamlide. Installare il corpo principale sopra la piastra inferiore.
- Aggiungere lentamente terreno di coltura alla camera. Non aggiungere il terreno di coltura troppo in fretta o il tessuto di interesse saranno disturbati. Non riempire completamente la camera per consentire lo scambio di gas sotto il coperchio.
- Posizionare con delicatezza il coperchio invisibile sulla parte superiore della camera di Chamlide.
Parte 4: Visualizzazione di migrazione di cellule gliali nel disco occhi.
- Posizionare la camera di cultura sul palcoscenico di un microscopio confocale o fluorescenza. Individuare l'esempio utilizzando il cerchio sul vetrino come riferimento il basso ingrandimento.
- Focus sul campione utilizzando un obiettivo 40x. Lasciare che il tessuto al depositarsi sui coprioggetti. Catturare le immagini del disco ottico dell'occhio o perseguitare ogni 10-15min in 3-4 ore. Il tessuto può contrarsi e spostarsi fuori fuoco. Messa a fuoco manuale il tessuto prima di acquisizione delle immagini allevierà °è un problema.
Parte 5: risultati Rappresentante:
Eseguita correttamente, il nostro protocollo ci ha permesso di raccogliere una serie di immagini di GFP-tagged cellule gliali che migrarono dal gambo ottica nel disco occhio immaginale (Figura 1 BD). Mentre immagini dal vivo per un periodo di 60 minuti è stato sufficiente a osservare i cambiamenti nelle posizioni dei nuclei gliali in un disco selvaggio occhio tipo immaginale, nuclei gliali in un mutante di un gene necessario per la migrazione delle cellule gliali completamente non è riuscito a uscire dal gambo di ottica (frecce Figura 1 FH).
Abbiamo colto occhio-cervello complessi per periodi fino a 240 minuti prima di osservare il deterioramento del tessuto coltura. In seguito i 240 minuti di tempo-punto si comincia a osservare le cellule GFP positive nel terreno di coltura circostante colto occhio-cervello complessi (freccia Figura 2 C). Inoltre in GFP si accumula nei punti diffuso in tutto il tessuto che suggerisce una rottura dell'integrità dei tessuti.
Figura 1: immagini dal vivo di GFP-tagged nuclei gliali del tipo di sviluppo selvaggio e mutante sistemi visivi.
A, E) delle immagini scattate con contrasto interferenziale differenziale (DIC) microscopio di colture di tipo selvatico e mutante occhio-immaginale dischi (ED). Nel tipo selvatico, le cellule gliali sono nato e migrano dal gambo ottica (OS) nell'occhio-disco. Il cervello è stata rimossa per facilitare l'appiattimento e l'imaging del disco occhio immaginale. BD) microscopia a fluorescenza del tipo selvatico disco occhio colto immaginale in (A) a 0, 30 e 60 punti tempo minuscolo rivela GFP-tagged nuclei gliali migrare all'interno del disco occhio.
FH) microscopia a fluorescenza del mutante occhio-cervello complesso (E) a 0, 30 e 60 punti dimostra un tempo minuscolo stallo di GFP-tagged nuclei gliali entro il gambo ottica (freccia). Il cervello (BR) è stato lasciato attaccato al peduncolo ottico per facilitare l'imaging della glia all'interno del gambo.
Figura 2: immagini dal vivo di GFP-tagged membrane gliali in un disco selvaggio occhio tipo immaginale. Abbiamo colto con successo occhio-cervello complessi per 240 minuti a periodi. Tessuto colto più di 240 minuti inizia a crollare. Il terreno di coltura che circonda il disco immaginale occhio (ED), pedinare ottica (OS), e del lobo cerebrale (BR) a 0 (A) e 150 minuti (B), rispetto al minuto 300 time-point (C), è libero di cellule GFP-positive, indicato da una freccia.
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Discussion
In questo protocollo si descrivono osservazione della migrazione delle cellule gliali nel disco occhio immaginale usando la microscopia dal vivo. Nel nostro esempio wild-type (figura 1 dC), abbiamo utilizzato un marcatore nucleare GFP per osservare il movimento delle cellule gliali nel disco occhio nel corso di un'ora. In un mutante di un gene candidato necessaria per la migrazione delle cellule gliali attualmente allo studio nel nostro laboratorio, abbiamo osservato uno stallo dei nuclei delle cellule gliali nel gambo di ottica nel corso di un periodo di un'ora (figura 1 EH). La nostra strategia può essere adattato per visualizzare ulteriori dettagli di comportamento cellulare regolata dal nostro gene di interesse. Ad esempio, una molecola di membrana mirata GFP, come mCD8-GFP, può essere espressa nelle cellule gliali di visualizzare i processi cellulari. L'uso di un marcatore legato membrana GFP ci permetterà di determinare se le cellule gliali nei nostri mutanti sono in grado di estendere i processi cellulari come filopodia nel disco occhio. Allo stesso modo actina taggati con GFP o tubulina taggati con GFP potrebbe essere espressa nella glia sviluppo di visualizzare le modifiche del citoscheletro durante la migrazione delle cellule gliali. Inoltre, l'esame delle singole GFP-etichettata cellule gliali mutanti possono essere visualizzate utilizzando la microscopia dal vivo (6). Questa tecnica ci permetterà di descrivere con maggiore precisione i requisiti per il nostro gene di interesse nel regolare la migrazione delle cellule gliali.
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Acknowledgments
Patrick Cafferty è supportato da una borsa di studio post-dottorato dalla Multiple Sclerosis Society of Canada.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
