Summary
यहाँ हम विकासशील ड्रोसोफिला रहते सूक्ष्म विश्लेषण GFP टैग glial कोशिकाओं के साथ रखा का उपयोग कर आँख में glial कोशिकाओं के प्रवास की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
दोनों हड्डीवाला और invertebrate जीवों के Glial कोशिकाओं अंतिम लक्ष्य क्षेत्रों की ओर पलायन ensheath करने के लिए आदेश में जुड़े न्यूरॉन्स समर्थन. जबकि हाल ही में प्रगति के लिए विकासशील pupal विंग, (1) के अध्ययन में glial कोशिकाओं के लाइव माइग्रेशन का वर्णन किया गया है
Protocol
भाग 1: पूर्व प्रयोगात्मक सेट अप.
- एक सप्ताह अग्रिम में दोस्त लार्वा उत्पन्न मक्खियों कि glial विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण के तहत व्यक्त GFP. हमारी प्रयोग के लिए हम एक परमाणु स्थानीयकरण (रेपो) उलट polarity के प्रमोटर (3, 4) का उपयोग glial कोशिकाओं में व्यक्त अनुक्रम के साथ टैग GFP visualized.
- कवर फिसल जाता है कम से कम एक दिन 10 मिनट के लिए 1% पाली एल lysine समाधान और शुष्क हवा रातोंरात में 18 मिमी दौर कवर फिसल जाता है भिगोने द्वारा अग्रिम में तैयार.
- प्रयोग के पहले दिन पर, 70% इथेनॉल में रातोंरात घटकों भिगोने द्वारा एक Chamlide चुंबकीय संस्कृति कक्ष साफ.
- प्रयोग के दिन, श्नाइडर कीट मध्यम सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर के 10 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान, और इंसुलिन जोड़कर संस्कृति के माध्यम से तैयार करते हैं. काम कर रहे सांद्रता हैं: 1X भ्रूण गोजातीय सीरम, 0.1mg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन; 100U/ml पेनिसिलिन और 0.2 मिलीग्राम / एमएल श्नाइडर कीट मध्यम में इंसुलिन (से संशोधित (5)).
- संस्कृति चैम्बर एक सेल संस्कृति हुड में शुष्क हवा करने की अनुमति दें. तैयार संस्कृति मध्यम के साथ rinsing द्वारा अवशिष्ट इथेनॉल धो संस्कृति कक्ष से.
भाग 2: ड्रोसोफिला जटिल आंख मस्तिष्क के विच्छेदन.
- एक तिहाई instar एक मक्खी शीशी और एक पेट्री डिश पर बर्फ पर ठंडा मध्यम संस्कृति की एक बूंद में कई मिनट के लिए जगह की ओर से भटक लार्वा का चयन करें. लार्वा द्रुतशीतन विच्छेदन के आराम के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला शरीर संकुचन धीमी गति से सिफारिश की है.
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे एक Sylgard लेपित पकवान पर मध्यम संस्कृति की एक बूंद में ठंडा लार्वा प्लेस.
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, Dumont ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें मजबूती लार्वा पीछे अंत से रास्ते से लगभग एक तिहाई समझ. रुको जब तक लार्वा पूर्वकाल अंत से अपने मुँह हुक extrudes. मुट्ठी मुँह पूर्ण विस्तार पर संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ हुक. लार्वा काटना, धीरे से विपरीत दिशाओं में संदंश के दो जोड़े खींच. आंख मस्तिष्क जटिल, लार की गिल्टी, वसा शरीर, और imaginal ऊतकों के साथ, लार्वा शरीर से दूर खींच जाएगा. खींच मुंह भी जल्दी अन्यथा हुक वे बंद आंख मस्तिष्क जटिल के आंसू जाएगा मत करो.
- लार की गिल्टी, वसा शरीर, और अल्ट्रा ठीक क्लिपर कैंची का उपयोग imaginal डिस्क दूर छाँटो. मस्तिष्क के दोनों गोलार्द्धों और आंख डिस्क वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड और मुँह के हुक से जुड़ी होगी.
- एक गिलास स्लाइड पर एक 18 मिमी कवर पर्ची रखें. कवर पर्ची स्लाइड के किनारे से फांसी क्रम में बाद में कवर पर्ची लेने के एक किनारे छोड़ दें. 18 मिमी कवर पर्ची पर मध्यम संस्कृति की एक बूंद जोड़ें. संस्कृति के माध्यम में संदंश के साथ हुक मुँह लोभी द्वारा आंख मस्तिष्क जटिल स्थानांतरण. आंख मस्तिष्क जटिल संदंश या ऊतक क्षतिग्रस्त हो जाएगा के साथ सीधे समझ नहीं करो.
- ठीक विच्छेदन कैंची का प्रयोग, बंद ट्रिम मुँह आंख मस्तिष्क जटिल और त्यागें से हुक. मुँह हुक के निकालना रहते इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में मुंह हुक संस्कृति ऊतक माइक्रोस्कोपी के दौरान स्थानांतरित करने के लिए कारण के माध्यम से अनुबंध के लिए जारी रहेगा.
- आँख imaginal डिस्क के भीतर glial प्रवास कल्पना, ध्यान से ऑप्टिक डंठल, पतली ऊतक कि मस्तिष्क और आंख डिस्क से जोड़ता है कटौती और दूर धक्का या मस्तिष्क त्यागें (आंकड़ा 1A देखें). ऑप्टिक डंठल भीतर glia कल्पना करने के लिए, मस्तिष्क, ऑप्टिक डंठल, और आंख imaginal बरकरार डिस्क (आंकड़ा 1E देखें) छोड़.
- संदंश का उपयोग coverslip उठाओ और हित के ऊतक के आसपास के नीचे एक स्थायी मार्कर के साथ एक वृत्त खींचना. इस चक्र माइक्रोस्कोपी के लिए 4 भाग में ऊतक का पता लगाने में सहायता करेगा.
भाग 3: एक चुंबकीय संस्कृति कक्ष में नजर imaginal डिस्क बढ़ते.
- संदंश का प्रयोग, coverslip की फांसी बढ़त समझ. Chamlide चुंबकीय कक्ष के नीचे की थाली के लिए संस्कृति में ऊतक के बिना परेशान coverslip स्थानांतरण.
- Chamlide चैम्बर के मुख्य शरीर पर सिलिकॉन O-अंगूठी रखें. मुख्य शरीर को नीचे की थाली के शीर्ष पर स्थापित करें.
- धीरे धीरे चैम्बर के लिए संस्कृति के माध्यम जोड़ें. मध्यम संस्कृति भी जल्दी या ब्याज के ऊतकों परेशान हो जाएगा मत जोड़ें. पूरी तरह से कक्ष भरने को कवर के तहत गैस आदान - प्रदान के लिए अनुमति नहीं है.
- धीरे Chamlide चैम्बर के शीर्ष पर अदृश्य कवर जगह है.
भाग 4: आँख डिस्क में glial कोशिकाओं पलायन के विज़ुअलाइज़ेशन.
- एक confocal या प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के मंच पर संस्कृति कक्ष रखें. कम बढ़ाई पर एक संदर्भ के रूप में coverslip पर वृत्त का उपयोग नमूना का पता लगाएँ.
- एक 40x लेंस का उपयोग कर नमूने पर ध्यान दें. ऊतक coverslip पर बसने के लिए अनुमति दें. आँख डिस्क या ऑप्टिक हर 3-4 घंटे से अधिक 10-15min डंठल की छवियों पर कब्जा. ऊतक चिकोटी और ध्यान से बाहर स्थानांतरित कर सकते हैं. छवि पर कब्जा करने से पहले मैन्युअल ऊतक ध्यान केंद्रित वें कम होगासमस्या है.
भाग 5: प्रतिनिधि के परिणाम:
सही ढंग से प्रदर्शन किया, हमारे प्रोटोकॉल हमें GFP टैग glial कोशिकाओं है कि आँख imaginal डिस्क (1 चित्रा बी) में ऑप्टिक डंठल से माइग्रेट की छवियों की एक श्रृंखला लेने के लिए अनुमति दी. जबकि एक 60 मिनट की अवधि के लिए रहते इमेजिंग glial नाभिक की स्थिति में परिवर्तन, एक जंगली प्रकार आँख imaginal डिस्क के भीतर का पालन करने के लिए पर्याप्त था एक glial सेल प्रवास के लिए आवश्यक जीन के लिए एक उत्परिवर्ती में glial नाभिक पूरी तरह से ऑप्टिक (डंठल तीर से बाहर करने में विफल रहा है चित्रा 1) एफएच.
हम सभ्य सुसंस्कृत ऊतक की गिरावट देख से पहले 240 मिनट के रूप में लंबे समय के रूप में समय के लिए आंख मस्तिष्क परिसरों है. 240 मिनट के समय बिंदु के बाद हम संस्कृति सभ्य आँख मस्तिष्क परिसरों (तीर चित्रा 2 सी) के आसपास मध्यम में GFP सकारात्मक कोशिकाओं का पालन शुरू करते हैं. इसके अलावा GFP ऊतक की अखंडता में एक टूटने सुझाव ऊतकों भर में फैलाना स्थानों में जमा करेंगे.
चित्रा 1: GFP टैग विकासशील जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती दृश्य प्रणालियों में glial नाभिक के लाइव इमेजिंग.
ए, ई) छवियाँ अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) सभ्य जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती आंख imaginal डिस्क (ईडी) के माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लिया. जंगली प्रकार में, glial कोशिकाओं में पैदा होते हैं और आंख डिस्क में ऑप्टिक डंठल (ओएस) से विस्थापित. मस्तिष्क को सपाट और आँख imaginal डिस्क इमेजिंग की सुविधा के लिए हटाया गया है. बी.डी.) (ए) 0 में, 30, और 60 मिनट का समय अंक से पता चलता है GFP टैग glial नाभिक आँख डिस्क के भीतर विस्थापित जंगली प्रकार सुसंस्कृत आँख imaginal डिस्क के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी.
एफएच) में () ई 0 में, 30, और 60 मिनट का समय अंक ऑप्टिक डंठल (तीर) के भीतर एक रोकने दर्शाता GFP टैग glial नाभिक के उत्परिवर्ती जटिल आंख मस्तिष्क के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी. मस्तिष्क (बीआर) छोड़ दिया गया है ऑप्टिक डंठल से जुड़ी डंठल भीतर glia की इमेजिंग की सुविधा.
चित्रा 2: एक जंगली प्रकार आँख imaginal डिस्क में GFP टैग glial झिल्ली के लाइव इमेजिंग. हम सफलतापूर्वक 240 मिनट की अवधि के लिए नजर मस्तिष्क परिसरों सुसंस्कृत है. टिशू कल्चरड 240 से अधिक लंबी मिनट के लिए नीचे तोड़ने के लिए शुरू होता है. संस्कृति मध्यम आसपास आँख imaginal डिस्क (ईडी), ऑप्टिक डंठल (ओएस), और 0 (ए) और 150 मिनट (बी) में मस्तिष्क लोब (BR), 300 मिनट के समय बिंदु (सी) की तुलना में, मुक्त है GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के एक तीर द्वारा संकेत.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में हम आँख imaginal रहते माइक्रोस्कोपी का उपयोग डिस्क में glial सेल प्रवास के अवलोकन का वर्णन. हमारे जंगली प्रकार उदाहरण (1 आंकड़ा ई.) में, हम एक परमाणु GFP मार्कर का इस्तेमाल आँख डिस्क में एक घंटे के कोर्स पर glial सेल आंदोलन का पालन. हमारी प्रयोगशाला में अध्ययन के अंतर्गत वर्तमान में glial सेल प्रवास के लिए आवश्यक एक उम्मीदवार जीन के लिए एक उत्परिवर्ती में, हम एक घंटे की अवधि के दौरान (1 आंकड़ा एह) ऑप्टिक डंठल के भीतर glial सेल नाभिक रोकने मनाया. हमारी रणनीति के लिए ब्याज की हमारे जीन द्वारा विनियमित सेलुलर व्यवहार की आगे विस्तार कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक झिल्ली GFP अणु लक्षित mCD8 - GFP जैसे, सेलुलर प्रक्रियाओं कल्पना glia में व्यक्त किया जा सकता है. एक झिल्ली बाध्य GFP मार्कर का प्रयोग हमें अगर हमारे म्यूटेंट में glial कोशिकाओं आँख डिस्क में filopodia जैसे सेलुलर प्रक्रियाओं को विस्तार देने के लिए सक्षम हैं निर्धारित करने के लिए अनुमति देगा. इसी तरह GFP या ट्यूबिलिन GFP के साथ टैग के साथ टैग actin के विकास glia में व्यक्त किया जा सकता cytoskeleton में glial सेल प्रवास के दौरान परिवर्तन की कल्पना. इसके अतिरिक्त, एकल GFP लेबल उत्परिवर्ती glial कोशिकाओं की परीक्षा रहते माइक्रोस्कोपी (6) का उपयोग visualized किया जा सकता. इस तकनीक को हमें और अधिक सही glial कोशिकाओं के प्रवास को विनियमित करने में हमारे जीन के लिए ब्याज की आवश्यकता का वर्णन करने के लिए अनुमति देगा.
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Acknowledgments
पैट्रिक Cafferty कनाडा के मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
