Summary
여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
척추 및 무척추 동물 생물 모두 Glial 세포 ensheath하기 위해서는 최종 대상 지역으로 마이 그 레이션과 관련된 뉴런을 지원해야합니다. 최근 진행은 개발 pupal 날개 (1)의 연구에 glial 세포의 라이브 마이 그 레이션을 설명하기 위해 만든되었습니다 있지만
Protocol
1 부 : 사전 실험 설정.
- 한 주 미리, 친구 유충을 생성하는 빠르다 glial 특정 발기인의 통제하에 표현 GFP. 우리의 실험에 대한 우리의 반대 극성 (repo) 발기인 (3, 4)를 사용 glial 세포에 표현 핵 로컬 라이제이션 시퀀스 태그 GFP를 시각.
- 1% 하룻밤 건조 폴리 - L - 라이신 솔루션과 공중에서 10 분 18mm 라운드 커버 전표를 몸으로로 사전에 최소한 1 일 이상 전표를 커버 준비합니다.
- 실험 전날, 70 % 에탄올에서 하룻밤 구성 요소를 몸으로하여 Chamlide 자기 문화 챔버 청소.
- 실험의 날, 무균 기술을 사용 슈나이더의 곤충 중간의 10 ML에 태아 소 혈청, 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 그리고 인슐린을 추가하여 문화 매체를 준비합니다. 작업 농도는 다음과 같습니다 1X 태아 소 혈청, 100U/ml 페니실린, 스트렙토 마이신 0.1mg/ml, 그리고 슈나이더의 곤충 매체 0.2 MG / ML 인슐린 ((5)에서 수정).
- 문화 챔버는 세포 배양 후드의 건조 공기를 허용합니다. 준비 문화 매체와 rinsing하여 문화 챔버에서 잔여 에탄올을 씻으십시오.
2 부 : Drosophila 눈 - 뇌 복합 해부.
- 몇 분 동안 얼음에 페트리 접시에 차게 문화 매체의 드롭 플라이 약병과 장소의 측면에서 타사 instar 방황하는 유충을 선택합니다. 유충 등골이 오싹한 것은 절개의 용이성을위한 연동 신체 수축 속도가 느린 것을 권장합니다.
- 해부 현미경 아래 Sylgard 코팅 접시에 배지의 드롭에 차게 유충를 놓습니다.
- 해부 현미경에서 단단히 후부 하순부터 방식의 약 3 분의 1을 유충을 파악하기 위해 더몬트 좋은 포셉 한 쌍의을 사용합니다. 유충은 앞쪽에 끝에서 그 입을 갈고리를 extrudes 때까지 기다리십시오. 입 전체 연장시 포셉의 두 번째 쌍의와 후크 파악. 유충을 해부하다하려면, 천천히 반대 방향으로 포셉의 두 쌍을 가져옵니다. 눈 - 뇌 단지, 침샘, 지방 기관 및 imaginal 티슈와 함께 애벌레 몸 가까이 끌어 것입니다. 입들이 눈 - 뇌 복합 찢을 것이다 빠르게 달리 너무 후크 당기지 마십시오.
- 침샘, 지방 기관 및 울트라 미세 클리퍼 가위를 사용하여 imaginal 디스크를 멀리 낸다. 두뇌와 눈 - 디스크의 두 반구는 복부 신경 코드와 구강 갈고리에 연결된 것입니다.
- 유리 슬라이드에 18mm 커버 전표를 놓습니다. 나중에 커버 슬립을 픽업하기 위해 슬라이드의 가장자리를 걸려 커버 슬립 중 하나 가장자리를 남겨주세요. 18mm 커버 슬립에 문화 매체의 드롭을 추가합니다. 포셉로 입 갈고리를 쥐고하여 문화 매체에 눈을 뇌의 복잡한을 전송합니다. 포셉 또는 조직이 손상됩니다 직접 눈 - 뇌 복합 파악하지 마십시오.
- 미세 해부 가위를 사용하여 입 눈 - 뇌 복잡하고 폐기에서 갈고리에서 트림. 입 후크는 조직 현미경 동안 이동하는 원인이 문화 매체에 계약을 계속으로 입 갈고리 제거 라이브 영상 중요합니다.
- 눈 imaginal 디스크 내에 glial 마이 그 레이션을 시각화하기 위해 조심스럽게 광 스토킹, 뇌 및 안구 디스크를 연결하는 얇은 조직을 잘라 (그림 1A 참조) 머리를 밀어 또는 폐기합니다. 광학 스토킹 이내 glia을 시각화하려면, 뇌, 광 스토킹하고, 그대로 눈을 imaginal 디스크 (그림 1E 참조) 두십시오.
- 포셉를 사용하여 coverslip을 선택하고 영구 마커와 관심의 조직 주위 밑에 원을 그려. 이 서클은 4 부의 현미경을위한 조직을 찾는데 도움이됩니다.
3 부 : 자기 문화 챔버의 눈을 imaginal 디스크를 장착.
- 포셉 사용하여 coverslip의 매달려 가장자리를 파악. 문화의 조직을 방해하지 않고 Chamlide 자기 챔버의 바닥 접시에 coverslip을 전송합니다.
- Chamlide 챔버의 본체에 실리콘 O - 링 놓습니다. 하단 플레이트 위에 본체를 설치합니다.
- 천천히 실로 문화 매체를 추가합니다. 너무 빨리 또는 관심의 조직이 방해되는 문화 매체를 추가하지 마십시오. 완전히 커버 아래의 가스 교환 수 있도록 챔버를 기입하지 마십시오.
- 부드럽게 Chamlide 챔버의 상단에있는 눈에 보이지 않는 덮개를 놓으십시오.
4 부 : 아이 디스크에 glial 세포를 마이 그 레이션의 시각화.
- 공촛점 또는 형광 현미경의 무대에서 문화 챔버를 놓습니다. 낮은 배율에서 참조로 coverslip에 동그라미를 사용하여 샘플을 찾습니다.
- 40x 렌즈를 사용하여 샘플에 초점. 조직이 coverslip에 정착하도록 허용합니다. 눈 디스크 또는 3-4시간 이상의 모든 10 - 15 광학 스토킹의 이미지를 캡처합니다. 조직 트위치과 집중을 밖으로 이동할 수 있습니다. 수동으로 이미지를 캡처하기 전에 조직을 중심으로하는 일을 경감됩니다문제가있다.
제 5 부 : 대표 결과 :
제대로 수행, 우리 프로토콜은 우리가 눈 imaginal 디스크 (그림 1 BD)로 광학 줄기에서 마이 그 레이션 GFP - 태그 glial 세포의 이미지 일련의를 수집하는있었습니다. 60 분 동안 라이브 이미지는 야생 타입 눈 imaginal 디스크 이내 glial 핵의 위치 변화를 관찰할 수있는 충분한 동안 glial 세포 마이 그 레이션에 필요한 유전자의 돌연변이에 glial 핵 완전히 광학 스토킹 (화살표를 종료하는 데 실패 그림 1 FH).
우리는 교양 조직의 저하를 관찰하기 전에 240분만큼 기간 동안 교양 눈 - 뇌 단지 있습니다. 240 분 시간이 지점에 따라 우리는 교양 눈 - 뇌 단지 (화살표 그림 2 C)를 둘러싼 문화 매체에 GFP 양성 세포를 관찰하기 시작합니다. 추가 GFP에서 조직의 무결성에 고장을 제안 조직 전반에 걸쳐 확산 장소에 축적됩니다.
그림 1 : 개발 야생 타입과 돌연변이 시각 시스템에서 GFP - 태그 glial 핵의 라이브 영상.
A, E) 이미지 차등 간섭 대비 (DIC) 교양 야생 유형과 돌연변이 눈을 imaginal 디스크 (ED)의 현미경을 사용하여 촬영. 야생 타입, glial 세포에서 태어나되고 눈을 디스크에 광학 스토킹 (OS)에서 마이 그 레이션. 머리가 납작하며 눈 imaginal 디스크의 이미지를 용이하게하기 위해 제거되었습니다. BD) (A) 0, 30, 및 60분 시간 포인트는 GFP - 태그 glial 핵은 눈 디스크 내에 마이 그 레이션 공개에 야생 유형 교양 눈 imaginal 디스크의 형광 현미경.
FH) (E) 0, 30, 및 60분 시간이 지점은 광학 스토킹 (화살표) 이내에 GFP - 태그 glial 핵의 연기를 보여줍니다에서 돌연변이 눈 - 뇌 복합 형광 현미경. 두뇌 (BR)은 줄기 내에서 glia의 이미지를 용이하게하기 위해 광학 줄기에 붙어 왼쪽으로되었습니다.
그림 2 : 야생 유형 눈 imaginal 디스크에 GFP - 태그 glial 세포막의 라이브 영상. 우리는 성공적으로 240 분 동안 눈을 두뇌 단지을 배양해 있습니다. 조직 교양 초과 240분 신경 쇠약하기 시작합니다. 300분 시간 점 (C)에 비해 눈에 imaginal 디스크를 둘러싼 문화 매체 (ED), 광학 스토킹 (OS), 0 (A) 150 분 (B)에서 두뇌 기억 상실증이 (BR), 무료 GFP 양성 세포의 화살표로 표시.
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Discussion
이 프로토콜에서는 라이브 현미경을 사용하여 눈을 imaginal 디스크에 glial 세포 이주의 관찰을 설명합니다. 우리의 야생 유형 예를 들어 (그림 1 AD)에서, 우리는 한 시간의 과정을 통해 아이 디스크에 glial 세포의 움직임을 관찰하기 위해 핵 GFP 표지를 사용했습니다. 현재 저희 연구실에서 공부를 아래에 glial 세포 마이 그 레이션에 필요한 후보 유전자에 대한 돌연변이, 우리는 한 시간 동안 (그림 1 EH) 동안 광학 스토킹 이내 glial 세포 핵의 연기를 관찰했다. 우리의 전략은 관심이 우리의 유전자에 의해 규제 세포 행동의 자세한 세부 사항을 시각화하기 위해 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 멤브레인, 이러한 mCD8 - GFP로 GFP 분자를 타겟으로 세포 프로세스를 시각화하는 glia로 표현하실 수 있습니다. 우리의 돌연변이에 glial 세포가 눈 디스크에 같은 filopodia 같은 세포 과정을 확대 할 수있다면 우리가 결정할 수있는 멤브레인 바운드 GFP 표지의 사용. 마찬가지로 GFP와 GFP 태그 또는 tubulin 태그 굴지는 glial 세포 이주 동안 cytoskeleton의 변화를 시각화하기 위해 개발 glia로 표현 될 수 있습니다. 또한 단일 GFP - 라벨이 돌연변이 glial 세포의 시험은 라이브 현미경 (6)를 사용하여 시각하실 수 있습니다. 이 기술은 우리가보다 정확하게 glial 세포의 마이 그 레이션을 규제에 대한 관심 우리의 유전자에 대한 요구 사항을 설명하실 수 있습니다.
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Acknowledgments
패트릭 카퍼티는 캐나다의 여러 경화증 협회에서 박사 친교에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
