Summary
الشيخوخة في الخميرة الزمني يشير الى فقدان قابلية الخلايا المرتبطة بها مع مرور الوقت في مرحلة ثابتة. نحن هنا وصف أسلوب الإنتاجية العالية لتحديد كميا مدى الحياة الخميرة زمني.
Abstract
الخميرة في مهدها
Protocol
الجزء 1 : التحضير للثقافات الشيخوخة
- سلالات متواصلة من الاهتمام من الأسهم المجمدة على لوحات أجار YEPD (1 خلاصة الخميرة ٪ و 2 ٪ bacto - ببتون ، أغار 2 ٪ ، السكر بنسبة 2 ٪).
- احتضان الخلايا في 30 ˚ مئوية لمدة 48 ساعة أو حتى تظهر المستعمرات واحد.
- اختيار واحد وتحصين المستعمرات في 5 مل من السائل YEPD المتوسطة (1 خلاصة الخميرة ٪ و 2 ٪ bacto - ببتون والجلوكوز 2 ٪) في أنابيب الاختبار.
- تنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 30 ˚ C مع المحافظة على التحريض المستمر باستخدام إما شاكر أو طبل الدوارة.
- تلقيح اصطناعي 5 مل من المتوسط (SC) كاملة (الجدول 1) مع 50 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها. مستعدون عموما ثلاث ثقافات SC لكل سلالة لتقديم ثلاث نسخ المتماثل البيولوجية للحياة تمتد لتحليل كل سلالة يجري فحصها.
- الحفاظ على الثقافات في 30 ˚ C مع التحريض المستمر على طبل الدوارة للتجربة بأكملها (عادة 2 أسابيع أو أكثر).
الجزء 2 : أخذ صلاحية سن نقطة
بعد يومين من ثقافة في وسائل الإعلام SC ، يجب أن تكون الخلايا في مرحلة ثابتة وأول سن نقطة على استعداد لاتخاذها. وينبغي اتخاذ سن لاحقة نقاط كل 2-3 أيام على الأقل لمدة اسبوعين. لكل نقطة العمر :
- إعداد Bioscreen 100 جيدا لوحات العسل لتلقيح عن طريق ملء كل بئر مع 145 ميكرولتر من YEPD. تأكد من ترك واحدة على الأقل مملوءة بشكل جيد مع YEPD فقط وجود خلايا لتحليل البيانات في وقت لاحق.
- إزالة الثقافات الشيخوخة من الحاضنة.
- دوامة لفترة وجيزة الثقافة أول من تلقيح في لوحة قرص العسل ، في حين يجري الحرص على عدم تسرب أي من الثقافة.
- إزالة 5 ميكرولتر من الثقافة المختلطة وماصة عليه في أول بئر من لوحة قرص العسل. الشعلة فم كل أنبوب اختبار قبل وبعد إزالة قسامة 5 ميكرولتر.
- كرر هذا الإجراء لكل ثقافة الشيخوخة وتأكد أن نلاحظ جيدا موقف المقابلة لكل ثقافة. وينبغي أن تستخدم بشكل جيد مواقف متطابقة في كل سن لاحقة نقطة في كافة مراحل التجربة برمتها.
- استبدال الثقافات في الحاضنة 30 م ˚ عند الانتهاء من عملية التلقيح.
الجزء 3 : تحميل وBioscreen آلة MBR C
- فضح مقصورة الحاضنة من خلال رفع الغطاء وإزالة الغطاء لعلبة العينة.
- إدراج لوحة تلقيح حديثا العسل في علبة العينة (استخدام فتحة اليسار اذا كنت تقرأ لوحة واحدة فقط).
- استبدال غطاء لعلبة العينة وخفض غطاء لمقصورة الحاضنة.
- تحقق للتأكد من السائل نقل الحرارة فوق مستوى ملء الدنيا. إذا منخفضة ، وإضافة المزيد من استخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع حرارة السائل نقل المقدمة.
- Bioscreen باستخدام البرمجيات "EZExperiment" ، تعيين المعلمات التالية للحصول على منحنيات نمو مناسبة للخميرة السكيراء :
- عدد العينات : أدخل عدد من الآبار مع وسائل الإعلام أو 200
- التصفية : 420 - 580m الطوق ، الاتساع
- درجة الحرارة : 30 ˚ C
- المدة التجربة : 1 يوم ، 0 ساعة ، 0 ثانية
- القياس الزمني : 30 دقيقة
- الهز : تشغيل ، تهز المستمر ، وارتفاع
- انقر على زر "ابدأ" لبدء القراءات.
الجزء 4 : تحليل البيانات
عادة ، يتم نقل ستة سن نقاط على مدار اسبوعين. تؤخذ نقطة العمر في أيام 2 و 4 و 6 و 9 و 11 و 13. اعتمادا على التصميم التجريبي والسلالات التي يجري اختبارها ، قد يكون من المرغوب فيه اتخاذ سن نقاط أكثر أو أقل أو لفترة أطول من 2 أسابيع. فمن المهم لتحميل لوحة قرص العسل في نفس الترتيب على كل نقطة في سن مثل هذه الثقافة أن كل الشيخوخة يتوافق مع موقف نفس البئر في كل نقطة في سن ، وهذا سيجعل تحليل البيانات أسهل بكثير.
- الحصول على ملفات الناتج من الجهاز Bioscreen MBR C. يقوم البرنامج "EZExperiment" إخراج البيانات Bioscreen كملف المفصول متوافق مع Microsoft Excel وكذلك برامج أخرى. ويبين العمود الأول في وقت ما تم أخذ القياس OD أثناء التجربة ، مع الأعمدة اللاحقة يمثل كل جيدا في لوحات العسل Bioscreen (الشكل 1).
- حذف OD القراءة الأولى من كل عمود. هذه القراءة هي "الضوضاء".
- تطبيع البيانات عن طريق طرح قيمة OD البئر YEPD مع كل القيم وحدها من التطوير التنظيمي في كل عمود. هذا يزيل الامتصاصية الخلفية بواسطة وسائل الإعلام.
- رسم المنحنيات ثمرة. ومنحنيات التحول بوصفها وظيفة من العمر (الشكل 2). على سبيل المثال ، عن طريق رسم المنحنيات ثمرة من العمود 1 (1 جيدا لوحة قرص العسل) على مدار الساعة النقاط الست ، هناك تحولا نحو اليمين متميزة من المنحنيات على مر الزمن.
- حساب الوقت مضاعفة (δ) لبناء جيدا كل على حركية النمو من سن يوم 2 نقطة. المعادلة المستخدمة لحساب الوقت مضاعفة طليالي :
حيث التطوير التنظيمي والتطوير التنظيمي 1 2 تمثل قياسات متتالية OD ور 1 و 2 ر يجري في الوقت بين القياسات. حساب مضاعفة مرات فقط بين القيم OD من 0.2 من 0.5. متوسط هذه القيم هي المرة مضاعفة لذلك جيدا. حساب مضاعفة مرات فقط بين القيم OD من 0.2 من 0.5. متوسط هذه القيم هي المرة مضاعفة لذلك جيدا. وينبغي أن معظم السلالات البرية من نوع الخميرة تعطي قيمة مضاعفة الوقت ما بين 85 إلى 90 دقيقة. - من أجل كل نقطة العمر ، وتحول لحساب الوقت (Δt) في منحنيات نمو بالنسبة للنقطة الأولي العمر (يوم 2). طريقة سهلة للقيام بذلك هي لتحديد الفرق في طول الوقت الذي استغرقته في كل جانب من أجل التوصل إلى OD 0.3 الأولي بين سن نقطة ولكل عصر لاحق نقطة. ويمكن حساب الوقت الذي وصل معين OD التي يعمل فيها 0.3 من معادلة الانحدار الخطي الموافق LN (OD) بوصفها وظيفة من الوقت بين أقواس two OD الوقت نقطة = 0.3.
- حساب نسبة الباقين على قيد الحياة عند كل نقطة في سن من أجل توليد منحنى البقاء على قيد الحياة (الشكل 3). تحديد سن الأولي نقطة (يوم 2) أن بقاء 100 ٪. من أجل كل نقطة على التوالي سن حساب بقاء في المئة باستخدام المعادلة التالية :
ق ن حيث نسبة البقاء على قيد الحياة هو ، Δt n هو التحول الوقت ، ون δ هي المرة مضاعفة. - إنشاء منحنيات البقاء على قيد الحياة (الشكل 3B) على النحو المرغوب فيه لكل (الآبار أو التكاثر) بشكل جيد من قبل المتهم بالتآمر في جزء (أو في المئة) من خلايا قابلة للحياة بوصفها وظيفة من العمر.
- حساب لا يتجزأ بقاء (SI) لكل بئر. كما يتم تعريف SI المنطقة تحت منحنى البقاء ويمكن تقديره من خلال المعادلة التالية :
ن حيث العصر هو عصر نقطة (مثل 2 و 4 و 6 و 9 و 11 و 13) وق ن هي قيمة البقاء في تلك المرحلة العمرية. - تحديد المعلمات الإحصائية الآبار نسخ من البيانات SI والبقاء. المعلمات الإحصائية ذات الاهتمام المشترك وتشمل تعني ، الوسيط ، والتباين لكل مجموعة من يعيد البيولوجية. ويمكن استخدام اختبار t أو تحليل مماثل للمقارنة البشرى من SI التجريبية لمختلف الجماعات والسيطرة عليها. قد يكون من المستحسن أيضا لتوليد منحنيات البقاء على قيد الحياة ، كما هو موضح في 4.8 من متوسط مكررات البيولوجية.
الجزء 5 : نتائج الممثل
عند الانتهاء من هذه التجربة ، سيكون لديك رسم منحنى البقاء وإجراء تحليل بيانات كافية لتحديد إمكانية ترتيب زمني الشيخوخة لعدة سلالات مختلفة أو شروط. إذا أجريت بشكل صحيح ، يجب أن منحنيات النمو التي حصل عليها من آلة Bioscreen MBR C تبدو مشابهة لتلك التي تظهر في الشكل (2) ومنحنيات البقاء على قيد الحياة مما ينبغي أن تشبه تلك التي تظهر في الشكل 3. عموما ، سوف البرية من نوع الخلايا المستزرعة في ظل الظروف الموصوفة هنا يكون متوسط العمر الزمني تمتد بناء على أمر من 7 أيام. لوحظ وجود تباين كبير في بقاء في سلالات مختلفة وفقا لبعض الشروط ، مثل النمو في وسائل الإعلام الجلوكوز بنسبة 0.05 ٪ ، يمكن أن متوسط بقاء تتجاوز 30 يوما.
بيانات الناتج الرقم 1. من "EZExperiment" Bioscreen البرنامج. يعرض العمود A في الوقت الذي اتخذ قراءة الامتصاصية. الأعمدة المتتالية تمثل آبار لوحة قرص العسل تلقيح مع خلايا مأخوذة من ثقافات الشيخوخة.
الشكل 2. منحنيات ثمرة من تكرار بيولوجية واحدة على مدار تجربة. هناك تحول واضح في منحنيات بمرور الوقت مع الخلايا في ثقافة الشيخوخة تفقد قدرتها على البقاء. طول الفترة الزمنية بين النقطة مرة الأولي (يوم 2) ونقطة زمنية متعاقبة يحدد صلاحية في ذلك سن معينة.
الشكل 3. أ) منحنى بقاء إنشاؤها باستخدام البيانات ثمرة من الشكل 1. يتم تعيين نقطة اليوم الساعة 2 كنقطة البقاء بنسبة 100 ٪. B) منحنيات البقاء على قيد الحياة الختامية لسلالتين اختباره في التجربة نفسها. هذه المنحنيات بقاء تمثل viabilities متوسط ثلاثة البيولوجية يعيد لكل سلالة. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري ضمن البيولوجية يتطابق. المنطقة المظللة تحت المنحنى بقاء يمثل جزءا لا يتجزأ البقاء على قيد الحياة (SI) لسلالة 1.
| الجدول 1. الاصطناعية المستخدمة لمعرفة متوسطة زمني دراسات الشيخوخة (سلالة backgrouBY4743 الثانية) | |
| مكون | تركيز (ز / لتر) |
| D - غلوكوز | 20 |
| الخميرة قاعدة النيتروجين (-AA/AS) | 1.7 |
| (NH 4) 2 SO 4 | 5.0 |
| الأدينين | 0.04 |
| L - ارجينين | 0.02 |
| L - حمض الأسبارتيك | 0.1 |
| L - حمض الجلوتاميك | 0.1 |
| الحامض الأميني L - | 0.1 |
| L - يسين | 0.3 |
| L - يسين | 0.03 |
| L - الميثيونين | 0.02 |
| L - فينيلالاناين | 0.05 |
| L - سيرين | 0،375 |
| L - ثريونين | 0.2 |
| تريبتوفان L - | 0.04 |
| L - التيروسين | 0.03 |
| L - حمض أميني أساسي | 0.15 |
| اليوراسيل | 0.1 |
ملاحظة : هذه وصفة لحسابات auxotrophies في سلالة BY4743 مضاعفا. ينبغي التعويض auxotrophies الأحماض الأمينية للبإضافة تركيز 5X النهائية والمتوسطة الكامل الاصطناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحياة زمني عالية الإنتاجية مقايسة تمتد الموصوفة هنا هو وسيلة فعالة لقياس القدرة الشيخوخة أعداد كبيرة من السلالات ذات الدقة العالية والدقة. التقدم الرئيسي لهذا الأسلوب أكثر من الطرق التقليدية لتحديد بقاء على قيد الحياة من خلال إحصاء الوحدات المكونة للمستعمرة (انظر على سبيل المثال 3) هو استخدام جهاز قراءة شاكر / الحاضنة / لوحة مثل آلة Bioscreen MBR C للحصول على منحنيات نمو عالية في القرار كل عصر نقطة. في مقارنة مباشرة مع المنخفضة الإنتاجية المقايسات الزمني العمر ، وقد تبين أن هذا الأسلوب لتحقيق مماثل (أو أفضل) من الدقة ، مع زيادة كبيرة في عدد العينات التي يمكن تحليلها 4.
الأسلوب كما هو موضح أعلاه هي مناسبة للكشف عن الاختلافات الوراثية لطول العمر الزمني في ظل ظروف تغير ثقافة تستخدم عادة للدراسات الشيخوخة. ويمكن بسهولة أن تتكيف هذه الطريقة ، ولكن لظروف ثقافة بديلة ، مثل التكيف المسبق للنمو الجهاز التنفسي (الجلسرين مصدر الكربون) 5 ، وصيانة المياه في وسائل الاعلام بدلا من منتهية الصلاحية ، أو دراسات لتقييد الغذائية 4. ويمكن أيضا التكيف لأغراض الفحص يمكن تصوره الدوائية ، على سبيل المثال بإضافة مركبات كيميائية مختلفة من مكتبة الى وسائل الاعلام بدلا من الشيخوخة بتلقيح سلالات مختلفة.
وصف الأسلوب هنا أيضا يوفر المرونة في نقطة العمر المستخدمة لتحديد مدى الحياة. على النحو الموصوف أعلاه ، تؤخذ سن نقاط في أيام 2 و 4 و 6 و 9 و 11 و 13 من هذه التجربة. هذه النقاط هي السن المناسبة لفحص حذف ORF جمع المسوخ مع الخميرة لمدى الحياة تتغير ، ولكن قد لا تكون مناسبة لتطبيقات أخرى ، والظروف والثقافة ، أو الخلفيات الوراثية. وتجدر الإشارة ، مع ذلك ، وهذا هو المطلوب إذا المقارنة بين تجارب متعددة ، يجب استخدام نفس مجموعة من النقاط في سن في كل تجربة.
أثناء أداء التجارب عمر زمني ، لاحظنا أن مجموعة فرعية من دوري الخلايا في ثقافة الشيخوخة وإعادة إدخال دورة الخلية ، ويشار إلى هذه الظاهرة بأنها "النزع الأخير" 6. ويمكن ملاحظة يلهث والتحول باتجاه اليسار في منحنى ثمرة واحدة أو أكثر في وقت لاحق العمر نقطة ، وهو ما يمثل زيادة في عدد خلايا قابلة للحياة في الثقافة الشيخوخة. يجب إزالة الثقافات حيث يلهث حدث من التحليل ، إلا البقاء هو بالفعل منخفضة بما فيه الكفاية أن سن لاحقة نقاط لن تؤثر بشكل كبير SI.
الصيانة الروتينية للآلة Bioscreen MBR C ضروري للحصول على بيانات دقيقة وطول العمر استنساخه. فمن الضروري أن يتم الاحتفاظ السائل نقل الحرارة فوق مستوى ملء الدنيا ، وينبغي التحقق من ذلك من قبل كل تشغيل على الجهاز. ومن المفيد أيضا لتنظيف دوري الداخلية للغرفة الحضانة التي مسح صينية لإزالة الغبار الناجمة عن استمرار اهتزاز لوحات العسل. سوف تحتاج أيضا إلى لمبة الاستعاضة مرة أو مرتين في السنة. رسالة خطأ F1.b2 يشير ضوء كاف من لمبة. انها فكرة جيدة للحفاظ على بصيلات الغيار عدة في متناول اليد.
وقد تم تحديد المسوخ والمواد الكيميائية التي تمتد يغير الحياة في حقيقيات النوى بسيطة قوة دافعة في مجال البحوث الشيخوخة على مدى السنوات العديدة الماضية. ذات أهمية خاصة هي تلك التدخلات التي الشيخوخة البطيء عبر الأنواع المتباينة تطويريا. ووصف عمر زمني المنهجية هنا قد ساهم في فهم الآليات الأساسية لدينا الشيخوخة في الخميرة في مهدها ، وتحديد العوامل التي يمكن أن طول الرواية يثبت في النهاية مفيدة كأهداف العلاجية لعلاج الأمراض المرتبطة بالسن في الناس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 1R21AG031965 - 01A1. عضو الكنيست هو باحث طبي جديد اليسون مؤسسة في الشيخوخة.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | Reagent | BD Biosciences | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | Reagent | BD Biosciences | 288620 | |
| Difco Agar | Reagent | BD Biosciences | 214530 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S. | Reagent | MidSci | J630-500G | |
| Amino Acids | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Ammonium Sulfate | Reagent | Spectrum | AM185 | |
| Dextrose | Reagent | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Bioscreen C MBR machine | Tool | Growth Curves USA | 5101370 | |
| Bioscreen 100-well Honeycomb plate | Tool | Growth Curves USA | 9502550 |
References
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).
- Kaeberlein, M. Handbook of models for human aging. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109 (2006).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).
- Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast. Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).
- Fabrizio, P., et al. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).
