Summary
Chronologische veroudering in gist verwijst naar het verlies van cel levensvatbaarheid geassocieerd met de tijd in de stationaire fase. Hier beschrijven we een high-throughput methode voor het kwantitatief bepalen van gist chronologische levensduur.
Abstract
De gist
Protocol
Deel 1: Voorbereiding van het ouder worden culturen
- Streak stammen van interesse van bevroren voorraden op YEPD agarplaten (1% gistextract, 2% Bacto-pepton, 2% agar, 2% glucose).
- Incubeer de cellen bij 30 ˚ C gedurende 48 uur of totdat enkele kolonies verschijnen.
- Pick enkele kolonies en enten in 5 ml YEPD vloeibaar medium (1% gistextract, 2% Bacto-pepton, 2% glucose) in reageerbuizen.
- Grow culturen 's nachts bij 30 ˚ C, terwijl je continu roert met behulp van een shaker of roller drum.
- Inoculeer 5 ml van synthetische complete (SC) medium (Tabel 1) met 50 pi van het 's nachts cultuur. Over het algemeen drie SC culturen zijn bereid voor elke stam te drievoud biologische replicatie van de levensduur analyse voor elke stam wordt onderzocht.
- Handhaaf de culturen bij 30 ˚ C met een constante agitatie op een roller trommel voor het hele experiment (doorgaans 2 of meer weken).
Deel 2: Het nemen van een levensvatbaarheid leeftijd-punt
Na twee dagen cultuur in SC media, moeten de cellen in de stationaire fase en het eerste jaar-point is klaar om te worden genomen. Latere leeftijd-punten moeten worden genomen om de 2-3 dagen voor een minimum van twee weken. Voor elke leeftijd punt:
- Bereid de Bioscreen 100-well platen Honingraat voor inoculatie door het invullen van elk putje met 145 pi van YEPD. Zorg ervoor dat u ten minste een goed gevuld te verlaten met alleen YEPD en geen cellen voor data-analyse later.
- Verwijder de veroudering culturen uit de incubator.
- Kort vortex de eerste cultuur te worden geënt in het Honeycomb plaat, terwijl ze voorzichtig om geen van de cultuur morsen.
- Verwijder de 5 pi van de gemengde cultuur en pipet het in de eerste putje van de honingraat plaat. Vlam de mond van elk reageerbuisje voor en na het verwijderen van de 5 pi aliquot deel.
- Herhaal deze procedure voor elke ouder worden cultuur en zorg ervoor dat de goed positie die overeenkomt met elke cultuur noot. Identieke goed posities moeten worden gebruikt voor elke volgende leeftijd-punt in het hele experiment.
- Vervang de culturen in de 30 ˚ C incubator wanneer u klaar bent met de inentingen.
Deel 3: Het laden van de Bioscreen C MBR machine
- Expose de incubator compartiment door het optillen van het deksel en verwijder het deksel om het monster lade.
- Plaats de nieuwe geïnoculeerde Honeycomb plaat in monsterhouder (gebruik de linker sleuf als je alleen het lezen van een plaat).
- Plaats het deksel op de steekproef lade en laat de deksel op de incubator compartiment.
- Controleer of de warmte-overdracht vloeistof is boven het minimum te vullen niveau. Indien laag, voeg meer met behulp van een 1000 pi pipet met de warmte die vloeistof.
- Met behulp van de Bioscreen software "EZExperiment", stel de volgende parameters om geschikte groeicurven voor Saccharomyces cerevisiae te krijgen:
- Aantal monsters: Voer het aantal putten met media of 200
- Filter: 420-580nm, Wideband
- Temperatuur: 30 ˚ C
- Experiment Lengte: 1 dag, 0 uur, 0 seconden
- Meetinterval: 30 minuten
- Schudden: aan, voortdurend schudden, High
- Klik op "Start" om metingen te beginnen.
Deel 4: Data Analysis
Typisch, zijn zes leeftijd-points die in de loop van twee weken. De leeftijd-punten zijn genomen op dag 2, 4, 6, 9, 11 en 13. Afhankelijk van het experimenteel ontwerp en stammen wordt getest, kan het wenselijk zijn de leeftijd-punten meer of minder vaak of langer dan 2 weken duren. Het is belangrijk om de honingraat plaat belasting in dezelfde volgorde voor elke leeftijd-point zodanig dat elke ouder de cultuur komt overeen met dezelfde goed te positioneren op elke leeftijd-point, want dit maakt data-analyse veel eenvoudiger.
- Verkrijgen van de output bestanden van de Bioscreen C MBR machine. De software "EZExperiment" zal de uitgang van de Bioscreen gegevens als een tab-gescheiden bestand dat compatibel is met Microsoft Excel en andere software. De eerste kolom laat zien op welk moment van de OD meting is genomen tijdens het experiment, met de daaropvolgende kolommen die elk putje in de Bioscreen Honeycomb platen (figuur 1).
- Verwijder de eerste OD lezen van elke kolom. Deze lezing is "ruis".
- Normaliseren van de gegevens door het aftrekken van de OD-waarde van het goed met alleen YEPD van alle OD waarden in elke kolom. Dit verwijdert de achtergrond absorptie door de media.
- Plot de uitgroei bochten. De curven zal verschuiven als functie van de leeftijd (figuur 2). Bijvoorbeeld door het plotten van de uitgroei curves van kolom 1 (goed een van de Honeycomb plaat) over de zes tijdstippen is er een duidelijke verschuiving naar rechts van de bochten in de tijd.
- Bereken de verdubbelingstijd (δ) voor elke goed op basis van de groei kinetiek van de dag 2 leeftijds-punt. De vergelijking gebruikt voor de verdubbeling van tijd te berekenen is:
waar de OD 1 en OD 2 opeenvolgende metingen OD en t 1 en t 2 wordt de tijd tussen de metingen te vertegenwoordigen. Bereken verdubbeling keer alleen tussen OD-waarden van 0,2 tot 0,5. Het gemiddelde van deze waarden is de verdubbeling tijd voor goed. Bereken verdubbeling keer alleen tussen OD-waarden van 0,2 tot 0,5. Het gemiddelde van deze waarden is de verdubbeling tijd voor goed. De meeste wild-type giststammen moet geven een verdubbeling van de tijd de waarde tussen de 85 tot 90 minuten. - Voor elke leeftijd-punt, het berekenen van de time-shift (At) in de uitgroei bochten ten opzichte van de initiële leeftijd-point (dag 2). Een gemakkelijke manier om dit te doen is om te bepalen het verschil in de lengte van de tijd die nodig was voor elke well met een buitendiameter van 0,3 te bereiken tussen de initiële leeftijd-point en elke volgende leeftijd-punt. De tijd dat een bepaald goed een OD van 0,3 bereikt, kan worden berekend uit de lineaire regressievergelijking die overeenkomt met ln (OD) als een functie van de tijd tussen de twee tijdstippen bracketing OD = 0,3.
- Bereken de fractie overlevende op elke leeftijd punt om een survival curve (figuur 3) te genereren. Definieer de initiële leeftijd-point (dag 2) tot 100% levensvatbaarheid. Voor elke volgende leeftijd-point Bereken het percentage overleven met behulp van de vergelijking:
waarbij s n is de overleving percentage, At n is de time-shift, en δ n is de verdubbeling van de tijd. - Genereer overlevingscurven (Figuur 3B) zoals gewenst voor elk goed (of kopiëren putten) door het plotten van de fractie (of percentage) van de levensvatbare cellen als een functie van de leeftijd.
- Bereken het voortbestaan integrale (SI) voor elk putje. SI wordt gedefinieerd als het gebied onder de curve overleven en kan worden geschat door de formule:
waar de leeftijd van n is de leeftijd-point (bijv. 2, 4, 6, 9, 11 en 13) en s n is de overleving waarde op die leeftijd-punt. - Bepaal statistische parameters van repliceren putten uit de SI en de overleving van gegevens. Gemeenschappelijke statistische parameters die van belang zijn gemiddelde, mediaan, en de variantie voor elke set van biologische repliceert. Een t-test of een soortgelijke analyse kan worden gebruikt voor de paarsgewijze vergelijking van SI voor verschillende experimentele en controlegroepen. Het kan ook wenselijk zijn om te overleven bochten, zoals beschreven in 4.8 van de gemiddelde biologische repliceert te genereren.
Deel 5: Representatieve resultaten
Bij de voltooiing van het experiment, dan heb je geplot het overleven curve en uitgevoerd data-analyse voldoende om de chronologische veroudering mogelijkheden voor verschillende stammen of voorwaarden vast te stellen. Als dit goed wordt uitgevoerd, moeten de groeicurven verkregen uit de Bioscreen C MBR machine lijken op die getoond in Figuur 2 en de daaruit voortvloeiende overlevingscurves moet lijken op die in figuur 3. Over het algemeen, wild-type cellen gekweekt onder de voorwaarden die hier beschreven wordt een mediane chronologische levensduur hebben op de orde van 7 dagen. Aanzienlijke variatie in overleving is waargenomen in verschillende stammen en onder bepaalde omstandigheden, zoals de groei van 0,05% glucose media, kan mediane overleving meer dan 30 dagen.
Figuur 1. Gegevens output van het Bioscreen programma "EZExperiment". Kolom A geeft het tijdstip waarop een absorptie lezen werd genomen. Opeenvolgende kolommen vertegenwoordigen de putjes van de plaat Honeycomb geënt met cellen van veroudering culturen.
Figuur 2. Uitgroei bochten van een enkele biologische repliceren in de loop van een experiment. Er is een duidelijke verschuiving in de bochten in de tijd als cellen in de vergrijzing van de cultuur te verliezen levensvatbaarheid. De lengte van de tijd tussen het eerste tijdstip (dag 2) en een keer op punt bepaalt levensvatbaarheid op die bepaalde leeftijd.
Figuur 3. A) Een survival curve gegenereerd met behulp van de uitgroei van gegevens uit figuur 1. De dag twee keer punt is ingesteld als de 100% levensvatbaarheid punt. B) definitieve overlevingscurven van de twee stammen getest in hetzelfde experiment. Deze overlevingscurven vertegenwoordigen het gemiddelde de levensvatbaarheid van de drie biologische herhalingen voor elke stam. Foutbalken geven de standaarddeviatie binnen de biologische repliceert. Het gearceerde gebied onder de survival curve geeft het voortbestaan integrale (SI) voor een stam.
| Tabel 1. Synthetische beschreven medium gebruikt voor het Chronologisch Aging Studies (stam background BY4743) | |
| Bestanddeel | Concentratie (g / L) |
| D-glucose | 20 |
| Yeast nitrogen base (-AA/AS) | 1.7 |
| (NH 4) 2 SO 4 | 5.0 |
| Adenine | 0.04 |
| L-Arginine | 0.02 |
| L-Asparaginezuur | 0.1 |
| L-Glutaminezuur | 0.1 |
| L-Histidine | 0.1 |
| L-Leucine | 0.3 |
| L-Lysine | 0.03 |
| L-Methionine | 0.02 |
| L-Fenylalanine | 0.05 |
| L-Serine | 0.375 |
| L-Threonine | 0.2 |
| L-Tryptofaan | 0.04 |
| L-Tyrosine | 0.03 |
| L-Valine | 0.15 |
| Uracil | 0.1 |
Opmerking: Dit recept is goed voor auxotrophies in diploïde BY4743 stam. Aminozuur auxotrophies moet worden gecompenseerd door het toevoegen van een 5X uiteindelijke concentratie aan de synthetische complete medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De high-throughput chronologische levensduur test hier beschreven is een effectieve methode voor het kwantificeren van de veroudering potentieel van grote aantallen van stammen met een hoge nauwkeurigheid en precisie. De primaire opmars van deze methode ten opzichte van klassieke methoden voor de bepaling te overleven door het tellen van kolonievormende eenheden (bijv. zie 3) is het gebruik van een shaker / incubator / plaat leesapparaat, zoals de Bioscreen C MBR machine met een hoge resolutie groeicurven te verkrijgen op elke leeftijd-punt. In directe vergelijking met een lage-throughput chronologische levensduur testen, is deze methode aangetoond dat vergelijkbaar (of beter) precisie te bereiken, terwijl een aanzienlijke verhoging van het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd 4.
De methode zoals hierboven beschreven is geschikt voor screening genetische varianten voor een lang leven veranderd chronologische onder veel gebruikte kweekomstandigheden voor veroudering studies. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast, maar voor alternatieve kweekomstandigheden, zoals pre-aanpassing aan de luchtwegen groei (glycerol koolstofbron) 5, onderhoud in het water in plaats van vervallen media, of studies van dieetbeperking 4. Aanpassing voor farmacologische screening kan ook worden bedacht, bijvoorbeeld door het toevoegen van verschillende chemische verbindingen van een bibliotheek om de vergrijzing van de media in plaats van inenten verschillende stammen.
De hier beschreven methode biedt ook voor flexibiliteit in de leeftijd-punten gebruikt voor de levensduur bepalen. Zoals hierboven beschreven, zijn leeftijd-punten genomen op dag 2, 4, 6, 9, 11 en 13 van het experiment. Deze leeftijd-punten zijn geschikt voor de screening van de gist ORF verwijderen collectie voor mutanten met veranderde levensduur, maar kan niet geschikt zijn voor andere toepassingen, kweekomstandigheden, of genetische achtergronden. Opgemerkt dient te worden echter, dat als vergelijking over meerdere experimenten gewenst is, moet dezelfde set van leeftijd-punten worden gebruikt in elk experiment.
In de loop van het uitvoeren van chronologische levensduur experimenten, hebben we geconstateerd dat periodiek een subset van cellen in de verouderende cultuur van de celcyclus opnieuw in te voeren, een fenomeen aangeduid als 'hijgend' 6. Happend kan worden waargenomen als een verschuiving naar links in de uitgroei-curve bij een of meer latere leeftijd-punten, wat overeenkomt met een toename van het aantal levensvatbare cellen in de vergrijzing van de cultuur. Culturen waar hijgend heeft plaatsgevonden moet worden verwijderd uit de analyse, tenzij levensvatbaarheid al laag genoeg is dat latere leeftijd-punten niet significant zal SI beïnvloeden.
Routine onderhoud van de Bioscreen C MBR machine nodig is om reproduceerbare en nauwkeurige levensduur gegevens te verkrijgen. Het is essentieel dat de koudedrager wordt gehouden boven het minimum vulniveau, en dit moet worden gecontroleerd voordat elke run op de machine. Het is ook nuttig om het interieur van de incubatiekamer regelmatig schoon te vegen de lade om stof te verwijderen die door voortdurend schudden van de honingraat platen. De lamp moet ook een of twee keer per jaar worden vervangen. Een F1.b2 foutmelding geeft onvoldoende licht van de lamp. Het is een goed idee om een aantal reserve lampen bij de hand.
De identificatie van mutanten en chemische stoffen die de levensduur in een eenvoudige eukaryoten te veranderen is een drijvende kracht geweest bij ouder onderzoek over de afgelopen jaren. Van bijzonder belang zijn die interventies die langzaam ouder worden over evolutionair uiteenlopende soorten. De chronologische levensduur methodiek die hier beschreven heeft bijgedragen aan ons begrip van de fundamentele mechanismen van ouder worden in de gist en de identificatie van nieuwe levensduur factoren die uiteindelijk kan nuttig zijn als therapeutische targets voor de behandeling van leeftijd-geassocieerde ziekten bij mensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH Grant 1R21AG031965-01A1. MK is een Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | Reagent | BD Biosciences | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | Reagent | BD Biosciences | 288620 | |
| Difco Agar | Reagent | BD Biosciences | 214530 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S. | Reagent | MidSci | J630-500G | |
| Amino Acids | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Ammonium Sulfate | Reagent | Spectrum | AM185 | |
| Dextrose | Reagent | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Bioscreen C MBR machine | Tool | Growth Curves USA | 5101370 | |
| Bioscreen 100-well Honeycomb plate | Tool | Growth Curves USA | 9502550 |
References
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).
- Kaeberlein, M. Handbook of models for human aging. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109 (2006).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).
- Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast. Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).
- Fabrizio, P., et al. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).
