כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

Summary

הזדקנות בשמרים כרונולוגית מתייחס לאובדן של כדאיות התא הקשורים זמן בשלב נייח. כאן אנו מתארים את שיטת תפוקה גבוהה עבור כמותית בקביעת תוחלת החיים בשמרים כרונולוגי.

Abstract

שמרים ניצני

Protocol

חלק 1: הכנת תרבויות הזדקנות

1. Streak זנים של עניין ממניות קפוא על גבי צלחות אגר YEPD (1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, אגר 2%, גלוקוז 2%).
2. דגירה התאים ב 30 ˚ C למשך 48 שעות או עד מושבות יחיד להופיע.
3. פיק מושבות יחיד לחסן לתוך 5 מ"ל של מדיום נוזלי YEPD (1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, גלוקוז 2%) במבחנות.
4. לגדול תרבויות לילה ב 30 ˚ C תוך שמירה על תסיסה מתמדת שימוש או שייקר או תוף הרים.
5. לחסן 5 מ"ל של מדיום מלאכותי (SC) שלמה (טבלה 1) עם 50 μL של תרבות לילה. בדרך כלל שלוש תרבויות SC מוכנים להתאמץ כדי לספק כל שכפול בשלושה עותקים הביולוגי של ניתוח תוחלת החיים עבור כל זן נבדק.
6. שמירה על תרבויות ב 30 ˚ C עם תסיסה מתמדת על תוף מכבש לצורך הניסוי כולו (בדרך כלל 2 או יותר שבועות).

חלק 2: לקיחת הכדאיות גיל נקודה

לאחר יומיים של התרבות SC התקשורת, התאים צריכים להיות בשלב נייחים הראשונה בגיל נקודת מוכן לקחת. לאחר גיל נקודות צריך לקחת כל 2-3 ימים למשך תקופה מינימלית של שבועיים. עבור כל נקודה גיל:

1. הכן את Bioscreen 100-גם צלחות הכוורת עבור חיסון ידי מילוי כל טוב עם 145 μL של YEPD. הקפד להשאיר לפחות אחד מילא היטב עם YEPD בלבד ולא התאים לניתוח נתונים מאוחר יותר.
2. הסר את התרבויות הזדקנות מן החממה.
3. מערבולת בקצרה את התרבות הראשון מחוסן לתוך הצלחת הכוורת, בעוד נזהרים שלא לשפוך את כל התרבות.
4. הסרת 5 μL של התרבות מעורבת פיפטה אותו היטב הראשון של הצלחת הכוורת. הלהבה את קצה הצינור כל בדיקה לפני ואחרי הסרת aliquot 5 μL.
5. חזור על הליך זה עבור כל תרבות הזדקנות להיות בטוח לציין את המיקום המתאים גם כל תרבות. עמדות גם זהים יש להשתמש עבור כל הבאים לגיל נקודה לאורך הניסוי כולו.
6. החלף את תרבויות לתוך 30 ˚ C החממה כאשר סיים עם חיסונים.

חלק 3: טעינת המכשיר Bioscreen C-MBR

1. לחשוף את תא חממה על ידי הרמת המכסה והסר את כיסוי למגש המדגם.
2. הכנס את צלחת הכוורת מחוסן החדש למגש מדגם (להשתמש בחריץ שמאל אם אתה רק קריאה אחת צלחת).
3. החזר את מכסה למגש מדגם ולהפחית את המכסה לתא האינקובטור.
4. בדוק כדי לוודא את הנוזל העברת החום הוא מעל פני המילוי המינימלי. אם נמוך, להוסיף יותר באמצעות פיפטה 1000 μL עם הנוזל החום העברת סיפק.
5. שימוש בתוכנה Bioscreen "EZExperiment", להגדיר את הפרמטרים הבאים כדי להשיג עקומות גדילה מתאים cerevisiae Saccharomyces:
   • מספר דוגמאות: הזן את מספר בארות עם התקשורת או 200
   • סנן: 420-580nm, פס רחב
   • טמפרטורה: 30 ˚ C
   • אורך הניסוי: יום 1, 0 שעות, 0 שניות
   • מרווח מדידה: 30 דקות
   • טלטול: ביום רועד, רציף, גבוהה
6. לחץ "התחל" כדי להתחיל בקריאה.

חלק 4: ניתוח נתונים

בדרך כלל, שישה לגיל נקודות נלקחים במשך שבועיים. גיל נקודות נלקחה ב 2 ימים, 4, 6, 9, 11 ו 13. בהתאם לעיצוב ניסיוני זנים למבחן, זה עשוי להיות רצוי לקחת לגיל נקודות פחות או יותר, לעתים קרובות או למשך זמן ארוך יותר מ -2 שבועות. חשוב לטעון את הכוורת צלחת באותו סדר עבור נקודת בגיל כל כך שכל תרבות הזדקנות מתאים לתפקיד גם באותה נקודה בכל גיל, כמו זו יהפכו את ניתוח הנתונים הרבה יותר קל.

1. השג את קבצי פלט מן המכונה C-MBR Bioscreen. התוכנה "EZExperiment" יהיה פלט הנתונים Bioscreen כקובץ מופרד באמצעות טאבים התואמת Microsoft Excel, כמו גם תוכנות אחרות. העמודה הראשונה מראה באיזו שעה המדידה OD צולמה במהלך הניסוי, עם עמודות עוקבות המייצגים כל היטב את הצלחות Bioscreen הכוורת (איור 1).
2. מחק את הקריאה הראשונה OD מהעמודה מדי. קריאה זו היא "רעש".
3. נרמל את הנתונים על ידי הפחתת ערך OD הבאר עם YEPD לבד כל עמודה מכל ערכי OD. זה מסיר את ספיגת רקע על ידי התקשורת.
4. מגרש את הקימורים תוצאה. עקומות יעבור כפונקציה של גיל (איור 2). לדוגמה, על ידי מתכננים את עקומות תולדה מעמודה 1 (גם 1 הצלחת הכוורת) על שש נקודות זמן, יש תזוזה ימינה של עקומות שונות לאורך זמן.
5. לחשב את זמן ההכפלה (δ) עבור כל מבוסס היטב על קינטיקה צמיחה של 2 יום לגיל נקודה. המשוואה לחישוב זמן ההכפלה is:
   
   שם OD OD ₁ ו ₂ מייצגים מדידות עוקבות OD ו-t ₁ ו t ₂ לעת עתה בין המדידות. חישוב הכפלת פעמים בלבד בין ערכי OD של 0.2 עד 0.5. הממוצע של ערכים אלה הוא זמן ההכפלה עבור היטב. חישוב הכפלת פעמים בלבד בין ערכי OD של 0.2 עד 0.5. הממוצע של ערכים אלה הוא זמן ההכפלה עבור היטב. רוב wild-type זני שמרים צריך לתת זמן הכפלת ערך בין 85 עד 90 דקות.
6. עבור כל נקודה גיל, לחשב את זמן המעבר (Δt) את עקומות תוצאה יחסית הראשונית לגיל נקודה (יום 2). דרך קלה לעשות זאת היא לקבוע את ההבדל משך הזמן שנדרש גם כל להגיע OD של 0.3 בין ראשוני לגיל נקודה וכל הבאים לגיל נקודה. השעה מסוים הגיעו גם OD של 0.3 ניתן לחשב מתוך המשוואה רגרסיה ליניארית המתאים ln (OD) כפונקציה של זמן בין שתי נקודות זמן שניצבות OD = 0.3.
7. חישוב חלק לשרוד בשלב בגיל זה על מנת ליצור עקומת ההישרדות (איור 3). הגדר הראשוני לגיל נקודה (יום 2) להיות הכדאיות של 100%. עבור כל רצופים גיל נקודת לחשב את אחוז ההישרדות באמצעות המשוואה:
   
   שם של _n הוא אחוז ההישרדות, Δt _n הוא שינוי הזמן, δ _n הוא זמן ההכפלה.
8. הפקת עקומות ההישרדות (איור 3B) הרצוי עבור כל (או לשכפל בארות) גם על ידי מתכננים את השבר (או אחוז) של תאים קיימא כפונקציה של גיל.
9. חישוב נפרד ההישרדות (SI) עבור כל טוב. ת"י מוגדר כשטח תחת עקומת ההישרדות יכול להיות מוערך על ידי הנוסחה:
   
   גיל _n היכן הוא הגיל נקודות (לדוגמא: 2, 4, 6, 9, 11 ו 13) ו-S _n הוא ערך הישרדותי בנקודה בגיל זה.
10. קביעת פרמטרים סטטיסטיים של בארות לשכפל מהנתונים SI והישרדות. פרמטרים סטטיסטיים נפוצים עניין כוללים חציון מתכוון, ו שונות עבור כל קבוצה של הביולוגי משכפל. T-test או ניתוח דומה ניתן להשתמש לצורך השוואה pairwise של SI עבור ניסויים שונים וקבוצות שליטה. זה יכול להיות גם רצוי ליצור עקומות הישרדות, כמתואר מ בממוצע ביולוגי משכפל ב 4.8.

חלק 5: תוצאות נציג

בסיום הניסוי, תצטרך להתוות את עקומת ההישרדות וביצע ניתוח נתונים מספיקים כדי לקבוע את פוטנציאל ההזדקנות הכרונולוגי של זנים שונים, או כמה תנאים. אם מבוצעת כראוי, עקומות גדילה המתקבל המכונה C-MBR Bioscreen צריך להיראות דומים לאלה שמוצג באיור 2 ואת עקומות הישרדות וכתוצאה מכך צריכה להיות דומה לאלה שמוצג באיור 3. באופן כללי, wild-type תאים בתרבית בתנאים שתוארו כאן תהיה תוחלת החיים החציונית כרונולוגי בסדר גודל של 7 ימים. וריאציה משמעותית הישרדות היא נצפתה זנים שונים תחת כמה תנאים, כגון גדילה בתקשורת גלוקוז 0.05%, חציון ההישרדות יכול לעלות על 30 ימים.

1. באיור נתונים פלט מן "EZExperiment" Bioscreen התוכנית. טור מציג את הזמן שבו קריאה ספיגת נלקח. עמודות רצופים לייצג את בארות הצלחת הכוורת מחוסן עם תאים שנלקחו מתרבויות ההזדקנות.

איור 2. עקומות תולדה מן לשכפל ביולוגי אחד במהלך ניסוי. יש שינוי בולט עקומות במשך הזמן התאים בתרבית ההזדקנות לאבד הכדאיות. משך הזמן בין נקודת הזמן הראשונית (יום 2) ונקודת זמן רצופים קובע הכדאיות בגיל מסוים.

איור 3. א) עקומת ההישרדות שנוצר באמצעות הנתונים תולדה של איור 1. 2 ביום נקודת זמן מוגדר כנקודת את הכדאיות של 100%. B) עקומות הישרדות הסופי של שני הזנים שנבדקו בניסוי זהה. אלה עקומות הישרדות לייצג את viabilities ממוצע של שלושה ביולוגיים משכפל עבור כל זן. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן תוך ביולוגי משכפל. אזור מוצל מתחת לעקומה מייצג את הישרדות הישרדות אינטגרלי (SI) עבור זן 1.

טבלה 1. מוגדר בינוני סינתטי משמש ללימודי הזדקנות כרונולוגית (זן backgrouBY4743 nd)
רכיב	ריכוז (g / L)
D-גלוקוז	20
חנקן שמרים הבסיס (-AA/AS)	1.7
(NH 4) 2 SO 4	5.0
אדנין	0.04
L-ארגנין	0.02
L-חומצה אספרטית	0.1
L-חומצה גלוטמית	0.1
L-היסטידין	0.1
L-לאוצין	0.3
L-ליזין	0.03
L-מתיונין	0.02
L-פנילאלנין	0.05
L-סרין	0.375
L-תראונין	0.2
L-טריפטופן	0.04
L-tyrosine	0.03
L-valine	0.15
אורציל	0.1

הערה: מתכון זה מהווה auxotrophies ב זן דיפלואידי BY4743. Auxotrophies חומצות אמינו צריך להיות מתוגמל על ידי הוספת הריכוז הסופי 5X למדיום להשלים סינתטי.

Discussion

תפוקה גבוהה כרונולוגי תוחלת החיים assay המתוארת כאן היא שיטה יעילה לכימות פוטנציאל התיישנות מספר גדול של זנים עם דיוק דיוק גבוהה. ההתקדמות העיקרית של שיטה זו על פני שיטות קלאסיות לקביעת הישרדות ידי ספירת המושבה להרכיב יחידות (לדוגמא: לראות ³⁾ הוא השימוש במכשיר שייקר / חממה / צלחת קריאה כמו מכונה C-MBR Bioscreen להשיג רזולוציה גבוהה עקומות צמיחה בכל גיל נקודה. לשם השוואה ישירה עם תפוקה נמוכה תוחלת החיים מבחני כרונולוגי, שיטה זו הוכח להשיג דיוק דומה (או יותר), בעוד משמעותי להגדלת מספר דגימות כי ניתן לנתח ^4.

השיטה כפי שתואר לעיל מתאים להקרנה וריאנטים גנטיים לאריכות ימים כרונולוגי שונה בתנאים תרבות נפוץ ללימודי ההזדקנות. שיטה זו יכולה בקלות להיות מותאם עם זאת, התנאים תרבות אלטרנטיביים, כגון הסתגלות טרום לצמיחה הנשימה (פחמן מקור גליצרול) ^5, תחזוקה במים ולא בתקשורת פג, או מחקרים של הגבלה תזונתית ^4. הסתגלות למטרות הקרנת תרופתי יכול להיות גם חזה, למשל על ידי הוספת תרכובות כימיות שונות מספריית לתקשורת ההזדקנות ולא inoculating זנים שונים.

השיטה המתוארת כאן גם מספק גמישות הגיל נקודות המשמש לקביעת תוחלת החיים. כפי שתואר לעיל, בגיל נקודות נלקחה ב 2 ימים, 4, 6, 9, 11 ו 13 של הניסוי. אלה לגיל נקודות מתאימים ההקרנה אוסף שמרים ORF המחיקה עבור מוטנטים עם תוחלת חיים שונה, אבל לא יכול להיות מתאים ליישומים אחרים, תנאי התרבות, או רקע גנטי. יצוין, עם זאת, כי אם השוואה על פני מספר רב של ניסויים הוא הרצוי, אותה קבוצה של גיל נקודות צריך להשתמש בכל ניסוי.

במהלך ביצוע ניסויים כרונולוגי תוחלת החיים, יש לנו לציין, כי מעת לעת תת קבוצה של תאים בתרבית ההזדקנות יהיה להזין מחדש את מחזור התא, תופעה המכונה "מתנשף" ^6. מתנשם ומתנשף ניתן לצפות כמו משמרת שמאלה בעיקול תוצאה באחד או יותר בגיל מאוחר יותר נקודות, המתאים לגידול במספר התאים קיימא בתרבות ההזדקנות. תרבויות שבו מתנשם אירעה יש להסיר מן הניתוח, אלא אם כן הכדאיות כבר נמוך מספיק, כי לאחר מכן לגיל נקודות לא תהיה השפעה משמעותית SI.

תחזוקה שוטפת של המכונה C-MBR Bioscreen יש צורך לקבל נתונים אריכות ימים לשחזור מדויק. זה חיוני כי הנוזל העברת החום נשמר מעל פני המילוי המינימום, ואת זה יש לבדוק קודם כל להפעיל את המכונה. הוא גם מועיל מעת לעת לנקות את פנים החדר הדגירה על ידי מנגב את המגש כדי להסיר אבק שנוצר על ידי רעד מתמשך של הצלחות הכוורת. הנורה גם צריך להיות מוחלף פעם או פעמיים בשנה. הודעת שגיאה F1.b2 מציין אור מספקת של הנורה. זה רעיון טוב לשמור נורות חילוף מספר על היד.

זיהוי מוטנטים כימיקלים המשנים תוחלת החיים של אאוקריוטים פשוט הייתה הכוח המניע במחקר ההזדקנות בשנים האחרונות. עניין מיוחד הם התערבויות אלה הזדקנות איטית על פני זנים חריגים מבחינה אבולוציונית. המתודולוגיה כרונולוגי תוחלת החיים המתואר כאן תרם להבנת המנגנונים הבסיסיים של הזדקנות בשמרים ניצני וזיהוי של אריכות ימים גורמים רומן שבסופו של דבר יכול להיות שימושי כמטרות טיפוליות לטיפול בגיל הקשורים למחלות אצל אנשים.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Peptone	Reagent	BD Biosciences	211677
Bacto Yeast Extract	Reagent	BD Biosciences	288620
Difco Agar	Reagent	BD Biosciences	214530
Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.	Reagent	MidSci	J630-500G
Amino Acids	Reagent	Sigma-Aldrich
Ammonium Sulfate	Reagent	Spectrum	AM185
Dextrose	Reagent	Fisher Scientific	D16-10
Bioscreen C MBR machine	Tool	Growth Curves USA	5101370
Bioscreen 100-well Honeycomb plate	Tool	Growth Curves USA	9502550