आयु कक्ष के परिणाम के द्वारा खमीर कालानुक्रमिक लाइफ स्पैन बढ़ाता

Summary

खमीर में कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने स्थिर चरण में समय के साथ जुड़े सेल व्यवहार्यता की हानि करने के लिए संदर्भित करता है. यहाँ हम मात्रात्मक खमीर कालानुक्रमिक जीवन अवधि का निर्धारण करने के लिए एक उच्च throughput विधि का वर्णन.

Abstract

नवोदित खमीर

Protocol

भाग 1: उम्र बढ़ने संस्कृतियों की तैयारी

1. YEPD अगर प्लेटों पर जमे हुए (1% खमीर निकालने, 2% bacto - peptone, अगर 2%, 2% ग्लूकोज) के शेयरों से ब्याज की स्ट्रीक उपभेदों.
2. 30 में ˚ 48 घंटे के लिए सी या एकल कालोनियों दिखाई देते हैं जब तक कोशिकाओं को सेते हैं.
3. YEPD तरल माध्यम परीक्षण नलियों में (1% खमीर निकालने, 2% bacto - peptone, 2% ग्लूकोज) के 5 एमएल में एकल कालोनियों और टीका लगाना उठाओ.
4. 30 में रातोंरात संस्कृतियों ˚ सी जबकि लगातार आंदोलन को बनाए रखने या तो एक प्रकार के बरतन या रोलर ड्रम का उपयोग कर. बढ़ने
5. रातोंरात संस्कृति के 50 μL के साथ सिंथेटिक पूरा मध्यम (एससी) के 5 एमएल (1 टेबल) का टीका लगाना. आम तौर पर तीन अनुसूचित जाति संस्कृतियों प्रत्येक के लिए प्रत्येक जांच की जा रही तनाव के लिए तीन प्रतियों जीवन काल विश्लेषण के जैविक प्रतिकृति प्रदान तनाव के लिए तैयार हैं.
6. 30 में संस्कृतियों बनाए रखें ˚ सी पूरे प्रयोग (आमतौर पर 2 या अधिक सप्ताह) के लिए एक रोलर ड्रम पर लगातार आंदोलन के साथ.

भाग 2: एक उम्र बिंदु व्यवहार्यता लेना

अनुसूचित जाति मीडिया में संस्कृति के दो दिनों के बाद, कोशिकाओं को स्थिर चरण में हो सकता है और आयु बिंदु पहले लिया जा करने के लिए तैयार है. बाद के उम्र अंक हर लिया जा 2-3 दिन दो सप्ताह की एक न्यूनतम के लिए. प्रत्येक उम्र के बिंदु के लिए:

1. YEPD के 145 μL के साथ हर अच्छी तरह से भरने के द्वारा टीकाकरण के लिए Bioscreen 100 अच्छी तरह मधुकोश प्लेटें तैयार करें. केवल YEPD और डेटा विश्लेषण के लिए कोई कक्ष बाद के साथ कम से कम अच्छी तरह से भरा छोड़ सुनिश्चित करें.
2. इनक्यूबेटर से उम्र बढ़ने की संस्कृतियों निकालें.
3. संक्षेप में भंवर पहली मधुकोश थाली में inoculated हो सकता है, जबकि संस्कृति के किसी भी गिर नहीं सावधान किया जा रहा है संस्कृति.
4. मिश्रित संस्कृति के 5 μL निकालें और यह मधुकोश थाली के पहले अच्छी तरह से में पिपेट. लौ से पहले और 5 μL विभाज्य को हटाने के बाद प्रत्येक टेस्ट ट्यूब का मुँह.
5. प्रत्येक उम्र बढ़ने के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक संस्कृति को इसी स्थिति नोट सुनिश्चित किया जा रहा संस्कृति के लिए यह प्रक्रिया दोहराएँ. समान अच्छी तरह से पदों पर प्रत्येक आयु बिंदु के बाद पूरे प्रयोग के दौरान के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
6. 30 ˚ सी इनक्यूबेटर में संस्कृतियों बदलें जब inoculations के साथ समाप्त.

भाग 3: Bioscreen सी MBR मशीन लोड हो रहा है

1. ढक्कन उठाने इनक्यूबेटर डिब्बे बेनकाब और नमूना ट्रे के लिए कवर को हटा दें.
2. नमूना ट्रे (बाएँ स्लॉट का उपयोग करें यदि आप केवल एक प्लेट पढ़ रहे हैं) में नव inoculated मधुकोश थाली डालें.
3. नमूना ट्रे कवर बदलें और इनक्यूबेटर डिब्बे ढक्कन कम.
4. यकीन है कि गर्मी हस्तांतरण द्रव न्यूनतम भरने के स्तर से ऊपर है बनाने की जाँच करें. कम अगर, अधिक गर्मी हस्तांतरण द्रव प्रदान के साथ एक 1000 μL पिपेट का उपयोग कर जोड़ने.
5. Bioscreen सॉफ्टवेयर "EZExperiment" का प्रयोग, निम्न पैरामीटर सेट Saccharomyces cerevisiae के लिए उपयुक्त वृद्धि घटता प्राप्त:
   • नमूनों की संख्या: मीडिया या 200 के साथ कुओं की संख्या दर्ज करें
   • फिल्टर: 420-580nm Wideband
   • तापमान: 30 ˚ सी
   • प्रयोग लंबाई: 1 दिन, 0 घंटे, 0 सेकंड
   • मापन अंतराल: 30 मिनट
   • में, सतत मिलाते हुए, उच्च: हिलती
6. पर क्लिक करें "आरंभ" रीडिंग शुरू.

भाग 4: डेटा विश्लेषण

आमतौर पर, छह उम्र अंक दो सप्ताह के पाठ्यक्रम पर ले रहे हैं. आयु अंक 2 दिन, 4, 6, 9, 11, और 13 पर ले रहे हैं. प्रयोगात्मक डिजाइन और परीक्षण किया जा रहा उपभेदों पर निर्भर करता है, यह वांछनीय हो सकता है उम्र अंक अधिक या कम बार या 2 सप्ताह से अधिक समय के लिए ले सकता है. यह महत्वपूर्ण है उसी क्रम में हर ऐसी है कि प्रत्येक उम्र बढ़ने संस्कृति हर उम्र के बिंदु पर ही अच्छी तरह से स्थिति से मेल खाती है है, के रूप में इस डेटा विश्लेषण बहुत आसान हो जाएगा उम्र बिंदु के लिए मधुकोश थाली लोड.

1. Bioscreen सी MBR मशीन से उत्पादन फ़ाइलें प्राप्त करते हैं. सॉफ्टवेयर "EZExperiment" है कि माइक्रोसॉफ्ट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य सॉफ्टवेयर Excel के साथ संगत है एक टैब - सीमांकित फ़ाइल के रूप में Bioscreen डेटा का उत्पादन होगा. प्रथम स्तंभ से पता चलता है क्या समय पर आयुध डिपो माप प्रयोग के दौरान लिया गया था, बाद Bioscreen मधुकोश प्लेटें (चित्रा 1) में प्रत्येक अच्छी तरह का प्रतिनिधित्व के कॉलम के साथ.
2. हर स्तंभ से पहली आयुध डिपो पढ़ने हटाएँ. यह पढ़ने 'शोर' है.
3. आयुध डिपो के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक स्तंभ में सभी आयुध डिपो मूल्यों से अकेले YEPD के मूल्य subtracting द्वारा डेटा सामान्यकरें. यह मीडिया द्वारा पृष्ठभूमि absorbance निकालता है.
4. प्लॉट परिणाम घटता. घटता उम्र के एक समारोह (चित्रा 2) के रूप में बदलाव होगा. उदाहरण के लिए, छह समय अंक पर स्तंभ 1 (अच्छी तरह से मधुकोश थाली के 1) से परिणाम घटता साजिश रचने के द्वारा, समय पर एक विशिष्ट घटता के दाहिनी ओर शिफ्ट है.
5. प्रत्येक अच्छी तरह से दिन आयु बिंदु 2 के विकास कैनेटीक्स पर आधारित के लिए दुगनी समय (δ) की गणना. मैं समीकरण दोहरीकरण के समय की गणना करने के लिए इस्तेमाल कियाs:
   
   जहां आयुध डिपो ₁ और ₂ आयुध डिपो लगातार आयुध डिपो माप और टी ₁ और ₂ टी माप के बीच के समय जा रहा है का प्रतिनिधित्व करते हैं. 0.5 से 0.2 के आयुध डिपो मूल्यों के बीच केवल दोहरीकरण बार की गणना. इन मूल्यों का औसत है कि अच्छी तरह के लिए दुगनी समय है. 0.5 से 0.2 के आयुध डिपो मूल्यों के बीच केवल दोहरीकरण बार की गणना. इन मूल्यों का औसत है कि अच्छी तरह के लिए दुगनी समय है. हाल जंगली प्रकार खमीर उपभेदों 85 से 90 मिनट के बीच एक दुगनी समय मान देना चाहिए.
6. प्रत्येक उम्र बिंदु के लिए, परिणाम घटता उम्र प्रारंभिक बिंदु (2 दिन) के सापेक्ष के समय में बदलाव (Δt) की गणना. एक आसान तरीका यह करने के लिए समय की लंबाई में अंतर यह एक अच्छी तरह से उम्र प्रारंभिक बिंदु है और प्रत्येक आयु बिंदु के बाद के बीच 0.3 के एक आयुध डिपो तक पहुँचने के लिए ले लिया निर्धारित है. समय है कि एक विशेष रूप से अच्छी तरह से 0.3 के एक आयुध डिपो पहुँच - दो समय अंक bracketing = आयुध डिपो 0.3 के बीच समय के एक समारोह के रूप में रेखीय प्रतिगमन एल.एन. करने के लिए इसी समीकरण (आयुध डिपो) से गणना की जा सकती है.
7. प्रत्येक उम्र के बिंदु पर क्रम में करने के लिए अस्तित्व की अवस्था (चित्रा 3) उत्पन्न जीवित अंश की गणना. प्रारंभिक बिंदु आयु (दिन 2) परिभाषित करने के लिए 100% व्यवहार्यता. प्रत्येक आयु लगातार बिंदु के लिए अस्तित्व प्रतिशत समीकरण का उपयोग कर की गणना:
   
   Δt _पता है, _जहां n अस्तित्व प्रतिशत बदलाव समय है, और _δ पता दुगनी समय है .
8. उम्र के एक समारोह के रूप में व्यवहार्य कोशिकाओं के अंश (या प्रतिशत) की साजिश रचने के द्वारा अस्तित्व घटता (चित्रा 3B) के रूप में प्रत्येक अच्छी तरह से (या नकल कुओं) के लिए वांछित उत्पन्न करता है.
9. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह अस्तित्व अभिन्न (एसआई) की गणना. एसआई अस्तित्व वक्र के तहत क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है और सूत्र द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है:
   
   जहां उम्र _पता बिंदु उम्र (2 उदाहरण के लिए, 4, 6, 9, 11, और 13) और _n कि उम्र के बिंदु पर अस्तित्व मूल्य है.
10. एसआई और अस्तित्व के डेटा को दोहराने के कुओं के सांख्यिकीय मापदंडों का निर्धारण करते हैं. ब्याज की आम सांख्यिकीय मापदंडों मतलब है, मंझला, और जैविक के प्रत्येक सेट प्रतिकृति के लिए विचरण शामिल हैं. एक टी परीक्षण या इसी तरह के विश्लेषण विभिन्न प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों के लिए एसआई की जोड़ो तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी वांछनीय हो सकता है अस्तित्व घटता है, के रूप में औसतन जैविक replicates से 4.8 में वर्णित उत्पन्न हो सकता है.

भाग 5: प्रतिनिधि के परिणाम

प्रयोग के पूरा होने पर, आप अस्तित्व वक्र और प्रदर्शन डेटा विश्लेषण प्लॉट किए जाते हैं कई अलग अलग उपभेदों या स्थितियों के लिए कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने की क्षमता का निर्धारण करने के लिए पर्याप्त होगा. अगर ठीक से प्रदर्शन किया, विकास Bioscreen सी MBR मशीन से प्राप्त घटता चित्रा 2 में दिखाया गया है उन लोगों के लिए समान लग रही है और परिणामस्वरूप अस्तित्व घटता चित्रा 3 में दिखाया गया है उन सदृश चाहिए चाहिए. आम तौर पर, जंगली प्रकार यहाँ वर्णित शर्तों के तहत संवर्धित कोशिकाओं 7 दिनों के आदेश पर एक औसत कालानुक्रमिक जीवन काल होगा. अस्तित्व में पर्याप्त विभिन्नता अलग उपभेदों में और 0.05% ग्लूकोज मीडिया में विकास के रूप में कुछ शर्तों के तहत, मनाया जाता है, बीच का अस्तित्व 30 दिनों से अधिक कर सकते हैं.

चित्रा 1. Bioscreen कार्यक्रम "EZExperiment" से डेटा निर्गम. स्तम्भ A समय प्रदर्शित करता है जिस पर एक absorbance पढ़ने लिया था. के बाद एक कॉलम मधुकोश उम्र बढ़ने संस्कृतियों से ली गई कोशिकाओं के साथ inoculated थाली के कुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 2 से एक प्रयोग के पाठ्यक्रम पर एक एकल जैविक को दोहराने के परिणाम घटता. वहाँ के रूप में उम्र बढ़ने की संस्कृति में कोशिकाओं व्यवहार्यता खो समय के साथ घटता में अलग बदलाव है. प्रारंभिक समय (2 दिन) बिंदु और एक लगातार समय बिंदु के बीच समय की लंबाई है कि विशेष रूप से उम्र में व्यवहार्यता निर्धारित करता है.

चित्रा 3. ए) एक अस्तित्व चित्रा 1 से परिणाम के डेटा का उपयोग करने के लिए उत्पन्न वक्र. दिन 2 समय बिंदु 100% की व्यवहार्यता बिंदु के रूप में सेट कर दिया जाता है. बी) के अंतिम दो उपभेदों के अस्तित्व घटता ही प्रयोग में परीक्षण किया. ये अस्तित्व घटता तीन की औसत viabilities जैविक प्रत्येक तनाव के लिए replicates प्रतिनिधित्व करते हैं. त्रुटि सलाखों जैविक प्रतिकृति के भीतर मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. अस्तित्व वक्र के तहत छायांकित क्षेत्र 1 तनाव के लिए अस्तित्व अभिन्न (एसआई) का प्रतिनिधित्व करता है.

तालिका 1. सिंथेटिक निर्धारित कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने अध्ययन के लिए प्रयुक्त मध्यम (तनाव backgrouBY4743 एन डी)
घटक	एकाग्रता (छ / एल)
डी शर्करा	20
खमीर नाइट्रोजन बेस (-AA/AS)	1.7
2 (एनएच 4) अतः 4	5.0
Adenine	0.04
एल Arginine	0.02
एल Aspartic एसिड	0.1
एल Glutamic एसिड	0.1
एल-हिस्टडीन	0.1
एल - Leucine	0.3
एल Lysine	0.03
एल-Methionine	0.02
एल-फेनिलएलनिन	0.05
एल - सेरीन	0.375
एल - threonine	0.2
एल - Tryptophan	0.04
एल - Tyrosine	0.03
एल-valine	0.15
Uracil	0.1

नोट: यह नुस्खा द्विगुणित BY4743 तनाव में auxotrophies के लिए खातों . एमिनो एसिड auxotrophies सिंथेटिक पूरा मध्यम के लिए एक 5X अंतिम एकाग्रता जोड़कर लिए मुआवजा दिया जाना चाहिए.

Discussion

कालानुक्रमिक उच्च throughput जीवन काल परख यहाँ वर्णित उच्च सटीकता और परिशुद्धता के साथ उपभेदों की बड़ी संख्या की उम्र बढ़ने की क्षमता बढ़ाता के लिए एक कारगर तरीका है. शास्त्रीय तरीकों पर इस विधि का प्राथमिक कॉलोनी के गठन इकाइयों (जैसे ³ देख) की गणना के द्वारा अस्तित्व का निर्धारण करने के लिए अग्रिम Bioscreen सी MBR मशीन जैसे / हिलनेवाला इनक्यूबेटर / प्लेट पढ़ने डिवाइस के उपयोग करने के लिए उच्च संकल्प विकास घटता प्राप्त है प्रत्येक उम्र बिंदु. कम throughput कालानुक्रमिक जीवन काल assays के साथ सीधे तुलना में, इस विधि करने के लिए तुलनीय सटीक (या बेहतर) प्राप्त करने के लिए, जबकि काफी हद तक कि ⁴ विश्लेषण किया जा सकता नमूने की संख्या में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है.

विधि ऊपर वर्णित के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल किया उम्र बढ़ने अध्ययन के लिए संस्कृति की शर्तों के तहत बदल कालानुक्रमिक दीर्घायु के लिए आनुवंशिक वेरिएंट की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है. इस विधि को आसानी से अनुकूलित कर सकते हैं तथापि पूर्व श्वसन विकास के लिए अनुकूलन (ग्लिसरॉल कार्बन ^{स्रोत)} 5, बजाय पानी में रखरखाव की अवधि समाप्त हो मीडिया के रूप में वैकल्पिक संस्कृति ^{शर्तों,} या आहार 4 प्रतिबंध के अध्ययन के लिए. औषधीय स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए अनुकूलन उदाहरण के लिए भी कर सकते हैं, एक पुस्तकालय से अलग उपभेदों inoculating बजाय उम्र बढ़ने मीडिया के लिए विभिन्न रासायनिक यौगिकों को जोड़कर अनुरूप हो.

विधि यहाँ भी वर्णित उम्र अंक जीवन काल निर्धारण के लिए इस्तेमाल में लचीलेपन के लिए प्रदान करता है. जैसा ऊपर वर्णित है, आयु अंक 2 दिन, 4, 6, 9, 11, और 13 के प्रयोग के पर ले रहे हैं. इन उम्र अंक बदल जीवन काल के साथ म्यूटेंट के लिए खमीर ओआरएफ विलोपन संग्रह स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन अन्य अनुप्रयोगों, संस्कृति की स्थिति, या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए तथापि, कि कई प्रयोगों भर में अगर तुलना की इच्छा है, उम्र के अंक का एक ही सेट में प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

कालानुक्रमिक जीवन काल प्रयोगों के प्रदर्शन के दौरान, हम उल्लेख किया है कि समय - समय पर उम्र बढ़ने की संस्कृति में कोशिकाओं का एक सबसेट कोशिका चक्र फिर ^{से प्रवेश} करेंगे, एक घटना 6 'हांफते' के रूप में भेजा. हांफते एक या एक से अधिक बाद अंक उम्र में एक परिणाम वक्र में बाई ओर शिफ्ट, उम्र बढ़ने की संस्कृति में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए इसी रूप में देखा जा सकता है. संस्कृतियों जहां हांफते हुई है विश्लेषण से हटाया जाना चाहिए, जब तक व्यवहार्यता पहले से ही काफी कम है कि बाद में उम्र अंक काफी एसआई को प्रभावित नहीं करेगा.

Bioscreen सी MBR मशीन के नियमित रखरखाव प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सटीक दीर्घायु डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. यह जरूरी है कि गर्मी हस्तांतरण द्रव न्यूनतम भरने के स्तर से ऊपर रखा जाता है, और इस मशीन पर हर रन से पहले जाँच की जानी चाहिए. यह भी मददगार है ट्रे पोंछते धूल हटाने के द्वारा बनाई गई मधुकोश प्लेटों के मिलाते हुए निरंतर द्वारा समय - समय पर ऊष्मायन कक्ष के इंटीरियर साफ. बल्ब भी एक या दो बार एक वर्ष से प्रतिस्थापित किया जा आवश्यकता होगी. एक F1.b2 त्रुटि संदेश बल्ब से अपर्याप्त प्रकाश इंगित करता है. यह एक अच्छा विचार है कि हाथ पर कई स्पेयर बल्ब रखना.

म्यूटेंट की पहचान और रसायन है कि सरल eukaryotes में जीवन काल बदल पिछले कई वर्षों से अधिक उम्र बढ़ने अनुसंधान में एक ड्राइविंग बल दिया गया है. विशेष हित के उन हस्तक्षेप evolutionarily मुक़्तलिफ़ प्रजातियों के पार है कि धीमी गति से उम्र बढ़ने कर रहे हैं. कालानुक्रमिक जीवन काल पद्धति यहाँ वर्णित नवोदित खमीर और उपन्यास दीर्घायु कारक है जो अंततः लोगों में उम्र जुड़े रोगों के इलाज के लिए चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में उपयोगी साबित हो सकता है है की पहचान करने में उम्र बढ़ने के बुनियादी तंत्र की हमारी समझ के लिए योगदान दिया है.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Peptone	Reagent	BD Biosciences	211677
Bacto Yeast Extract	Reagent	BD Biosciences	288620
Difco Agar	Reagent	BD Biosciences	214530
Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.	Reagent	MidSci	J630-500G
Amino Acids	Reagent	Sigma-Aldrich
Ammonium Sulfate	Reagent	Spectrum	AM185
Dextrose	Reagent	Fisher Scientific	D16-10
Bioscreen C MBR machine	Tool	Growth Curves USA	5101370
Bioscreen 100-well Honeycomb plate	Tool	Growth Curves USA	9502550