Summary
Invecchiamento cronologico di lievito si riferisce alla perdita di vitalità cellulare associato con il tempo in fase stazionaria. Qui si descrivono un elevato throughput metodo per determinare quantitativamente la durata della vita cronologico lievito.
Abstract
Il lievito in erba
Protocol
Parte 1: Preparazione delle colture invecchiamento
- Ceppi striscia di interesse da parte scorte congelate su piastre di agar YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto-peptone, 2% agar, 2% di glucosio).
- Incubare le cellule a 30 ˚ C per 48 ore o fino a singole colonie appaiono.
- Scegli singole colonie e inoculare in 5 ml di liquido YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto-peptone, 2% di glucosio) in provetta.
- Grow culture notte a 30 ˚ C, mantenendo costante agitazione utilizzando uno shaker o Rullo.
- Inoculare 5 ml di sintesi completa (SC), medio (Tabella 1) con 50 microlitri della cultura durante la notte. Generalmente tre culture SC sono preparati per ogni sforzo per assicurare la replica biologico triplice copia delle analisi ciclo di vita per ogni ceppo in esame.
- Mantenere le culture a 30 ˚ C con agitazione costante su un rullo di tamburo per l'intero esperimento (in genere 2 o più settimane).
Parte 2: Facendo una vitalità età-punto
Dopo due giorni di cultura in SC mezzi di comunicazione, le cellule devono essere in fase stazionaria e la prima età punto è pronto per essere preso. Successive età punti dovrebbero essere prese ogni 2-3 giorni per un minimo di due settimane. Per ogni punto di età:
- Preparare il Bioscreen piatti a nido d'ape 100-bene per l'inoculazione, compilando tutti i pozzetti con 145 ml di YEPD. Assicurarsi di lasciare almeno un pozzetto riempito solo YEPD e non le cellule per l'analisi dei dati in seguito.
- Rimuovere le culture invecchiamento dal termostato.
- Mescolare brevemente nel vortex la prima cultura ad essere inoculato nella piastra a nido d'ape, facendo attenzione a non versare della cultura.
- Prelevare 5 ml di cultura mista e pipetta in primo pozzo della piastra a nido d'ape. Fiamma la bocca di ogni provetta prima e dopo la rimozione dei 5 aliquota microlitri.
- Ripetere questa procedura per ogni cultura invecchiamento avendo cura di notare la posizione e corrispondenti a ciascuna cultura. Posizioni identiche bene dovrebbe essere utilizzato per ogni successiva età-point durante l'intero esperimento.
- Sostituire le culture nel 30 ˚ C incubatore al termine con la vaccinazioni.
Parte 3: Caricamento del Bioscreen C macchina MBR
- Esporre il vano incubatore sollevando il coperchio e rimuovere il coperchio per il vassoio campione.
- Inserire la nuova piastra inoculata a nido d'ape nel vassoio del campione (usare lo slot di sinistra se siete solo leggendo una piastra).
- Sostituire il coperchio per il vassoio campione e abbassare il coperchio del vano incubatrice.
- Verificare che il fluido termovettore è superiore al livello minimo di riempimento. Se basso, aggiungere più di 1000 con pipetta microlitri con il fluido termovettore in dotazione.
- Utilizzando il software Bioscreen "EZExperiment", impostare i seguenti parametri per ottenere curve di crescita adatto per Saccharomyces cerevisiae:
- Numero di campioni: Inserire il numero di pozzi con i media o 200
- Filtro: 420-580nm, a banda larga
- Temperatura: 30 ˚ C
- Esperimento Durata: 1 giorno, 0 ore, 0 secondi
- Intervallo di misura: 30 minuti
- Agitazione: On, scuotendo continuo, ad alta
- Fare clic su "Start" per iniziare la lettura.
Parte 4: Analisi dei dati
Solitamente, a sei anni-punti sono presi nel corso di due settimane. L'età punti sono prese a giorni 2, 4, 6, 9, 11 e 13. A seconda del disegno sperimentale e le tensioni in fase di sperimentazione, può essere opportuno tenere età punti più o meno frequentemente o per più di 2 settimane. E 'importante caricare la piastra a nido d'ape nello stesso ordine per ogni età-point in modo tale che ogni cultura invecchiamento corrisponde alla stessa posizione e ad ogni età-punto, perché in questo modo l'analisi dei dati molto più facile.
- Ottenere i file di output dalla macchina Bioscreen C MBR. Il "EZExperiment" software visualizzerà i dati Bioscreen come un file delimitato da tabulazioni che è compatibile con Microsoft Excel e altri software. La prima colonna indica a che ora la misura OD è stata presa durante l'esperimento, con le successive colonne rappresentano ciascun pozzetto nelle piastre Bioscreen a nido d'ape (Figura 1).
- Eliminare la prima lettura OD da ogni colonna. Questa lettura è "rumore".
- Normalizzare i dati sottraendo il valore OD del bene con YEPD solo da tutti i valori di OD in ogni colonna. Questo rimuove l'assorbanza di fondo da parte dei media.
- Tracciare la curva escrescenza. Le curve si sposterà in funzione dell'età (Figura 2). Per esempio, tracciando le curve escrescenza dalla colonna 1 (e 1 del piatto a nido d'ape) oltre i sei punti del tempo, c'è uno spostamento verso destra distinta delle curve nel tempo.
- Calcolare il tempo di raddoppio (δ) per ogni bene in base alla cinetica di crescita del giorno 2 età-point. L'equazione utilizzata per calcolare il tempo di raddoppio is:
dove OD OD 1 e 2 rappresentano successive misurazioni OD e t 1 e t 2 è il tempo tra le misurazioni. Calcola il raddoppio volte solo tra i valori OD di 0,2 a 0,5. La media di questi valori è il tempo di raddoppio per quel bene. Calcola il raddoppio volte solo tra i valori OD di 0,2 a 0,5. La media di questi valori è il tempo di raddoppio per quel bene. La maggior parte dei ceppi wild-type lievito dovrebbe dare un valore tempo di raddoppio tra 85 a 90 minuti. - Per ogni età-punto, calcolare il tempo di spostamento (At) nelle curve escrescenza relativi ai primi anni-punto (giorno 2). Un modo semplice per farlo è quello di determinare la differenza nella lunghezza del tempo impiegato per ogni bene per raggiungere un diametro di 0,3 tra il punto iniziale per età e ogni successiva età-point. Il tempo che un particolare così raggiunto un diametro di 0,3 può essere calcolato con l'equazione di regressione lineare corrispondente alla ln (OD) in funzione del tempo tra le due parentesi OD tempo-punti = 0,3.
- Calcolare la frazione di sopravvissuti ad ogni età-point al fine di generare una curva di sopravvivenza (Figura 3). Definire il punto iniziale per età (giorno 2) di essere al 100% vitalità. Per ogni successivo all'età punto calcolare la percentuale di sopravvivenza con l'equazione:
dove s n è la percentuale di sopravvivenza, Dt n è il turno di tempo, e δ n è il tempo di raddoppio. - Generare le curve di sopravvivenza (Figura 3B) come desiderato per ciascun bene (o pozzi replica) tracciando la frazione (o percentuale) di cellule vitali in funzione dell'età.
- Calcolare la sopravvivenza integrale (SI) per ogni bene. SI è definita come l'area sotto la curva di sopravvivenza e può essere stimato con la formula:
in cui l'età è l'età n-punto (per esempio 2, 4, 6, 9, 11 e 13) e s n è il valore di sopravvivenza a quell'età-point. - Determinare parametri statistici di pozzi replicare dai dati SI e la sopravvivenza. Comuni parametri statistici di interesse: media, mediana e varianza per ogni set di replica biologico. Una t-test o analisi simile può essere utilizzato per il confronto a coppie di SI a fini sperimentali e gruppi di controllo. Può anche essere auspicabile per generare le curve di sopravvivenza, come descritto in 4.8 da media biologici replica.
Parte 5: risultati Rappresentante
Al termine dell'esperimento, si dovrà tracciare la curva di sopravvivenza ed eseguito l'analisi dei dati sufficienti per determinare il potenziale di invecchiamento cronologico per diversi ceppi diversi o condizioni. Se eseguita correttamente, la crescita curve ottenute dalla macchina Bioscreen C MBR dovrebbe essere simile a quelli mostrati nella Figura 2 e le curve di sopravvivenza risultante dovrebbe essere simile a quelli mostrati nella figura 3. In generale, wild-type cellule coltivate nelle condizioni descritte qui avrà una durata di vita media per ordine cronologico di 7 giorni. Sostanziale variazione nella sopravvivenza si osserva in diversi ceppi e sotto alcune condizioni, come la crescita in media del glucosio 0,05%, la sopravvivenza mediana può superare i 30 giorni.
Figura 1. Uscita dati dal Bioscreen programma "EZExperiment". Una colonna visualizza l'ora in cui è stata presa una lettura di assorbanza. Colonne successive rappresentano la pozzetti della piastra a nido d'ape inoculati con cellule prelevate da culture invecchiamento.
Figura 2. Curve escrescenza da un singolo replicare biologico nel corso di un esperimento. C'è uno spostamento distinto nelle curve nel tempo come le cellule nella cultura invecchiamento perdono vitalità. Il periodo di tempo tra il punto di tempo iniziale (giorno 2) e un punto di tempo successivi determina la vitalità a questa età particolare.
Figura 3. A) Una curva di sopravvivenza generato utilizzando i dati escrescenza dalla Figura 1. I 2 punti di giorno è impostato come punto di vitalità del 100%. B), curve di sopravvivenza finale di due ceppi testati nello stesso esperimento. Queste curve di sopravvivenza Viabilità rappresentano la media di tre biologici repliche per ogni ceppo. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard all'interno biologici replica. L'area ombreggiata sotto la curva di sopravvivenza rappresenta la sopravvivenza integrale (SI) per il ceppo 1.
| Tabella 1. Sintetico di media definite utilizzate per cronologica Studi Invecchiamento (ceppo backgrou° BY4743) | |
| Componente | Concentrazione (g / L) |
| D-glucosio | 20 |
| Lievito di base di azoto (-AA/AS) | 1,7 |
| (NH 4) 2 SO 4 | 5.0 |
| Adenina | 0,04 |
| L-Arginina | 0,02 |
| L-acido aspartico | 0,1 |
| L-acido glutammico | 0,1 |
| L-Istidina | 0,1 |
| L-Leucina | 0,3 |
| L-lisina | 0,03 |
| L-metionina | 0,02 |
| L-Fenilalanina | 0,05 |
| L-Serina | 0,375 |
| L-treonina | 0,2 |
| L-triptofano | 0,04 |
| L-tirosina | 0,03 |
| L-Valina | 0,15 |
| Uracile | 0,1 |
Nota: Questa ricetta spiega auxotrophies diploidi BY4743 ceppo. Auxotrophies aminoacido deve essere compensata con l'aggiunta di una concentrazione 5X finale al terreno sintetico completo.
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Discussion
L'high-throughput vita saggio arco cronologico qui descritto è un metodo efficace per quantificare il potenziale di invecchiamento di un gran numero di ceppi con elevata accuratezza e precisione. L'anticipo principale di questo metodo rispetto ai metodi classici per stabilire la sopravvivenza contando unità formanti colonie (ad esempio vedi 3) è l'uso di un dispositivo di lettura shaker / incubatore / piastra, come la macchina Bioscreen C MBR di ottenere alta risoluzione curve di crescita a ogni età-point. Nel confronto diretto con bassa produttività test vita arco cronologico, questo metodo ha dimostrato di raggiungere comparabili (o migliori) di precisione, mentre aumentando notevolmente il numero di campioni che possono essere analizzati 4.
Il metodo come sopra descritto è adatto per lo screening varianti genetiche per alterato longevità cronologica in condizioni di coltura comunemente utilizzati per gli studi di invecchiamento. Questo metodo può essere facilmente adattato, tuttavia, per condizioni di cultura alternativa, come il pre-adattamento alla crescita delle vie respiratorie (fonte di carbonio glicerolo) 5, il mantenimento in acqua piuttosto che i media scadenza, o su studi di restrizione dietetica 4. Adattamento ai fini dello screening farmacologico può anche essere previsto, ad esempio con l'aggiunta di composti chimici diversi da una biblioteca ai media invecchiamento piuttosto che inoculando ceppi diversi.
Il metodo qui descritto anche da una flessibilità in età punti utilizzati per la determinazione della durata della vita. Come descritto in precedenza, all'età punti sono prese a giorni 2, 4, 6, 9, 11, e 13 di questo esperimento. Questi punti di età sono adatti per lo screening del lievito raccolta cancellazione ORF per mutanti con durata di vita alterati, ma potrebbe non essere adatto per altre applicazioni, condizioni di coltura o substrato genetico. Va notato, tuttavia, che se confronto tra gli esperimenti più si desidera, lo stesso gruppo di età punti deve essere usato in ogni esperimento.
Nel corso di eseguire esperimenti cronologico durata della vita, abbiamo notato che periodicamente un sottogruppo di cellule nella cultura invecchiamento rientrare nel ciclo cellulare, un fenomeno denominato 'senza fiato' 6. Ansimando si può osservare come uno spostamento verso sinistra della curva escrescenza a uno o più tardi all'età punti, corrispondenti ad un aumento del numero di cellule vitali nella cultura invecchiamento. Culture in cui si è verificato ansimante deve essere rimosso dall'analisi, a meno che la vitalità è già abbastanza basso che successive età punti non influenza in modo significativo SI.
Manutenzione ordinaria della macchina Bioscreen C MBR è necessario per ottenere dati longevità riproducibile ed accurato. E 'essenziale che il fluido termovettore viene mantenuta al di sopra del livello minimo di riempimento, e questo dovrebbe essere controllata prima di ogni corsa sulla macchina. E 'utile anche per pulire periodicamente l'interno della camera di incubazione strofinando il vassoio per rimuovere la polvere creata dal continuo scuotimento delle piastre a nido d'ape. Il bulbo sarà anche bisogno di essere sostituita una volta o due volte all'anno. Un messaggio di errore indica F1.b2 luce insufficiente dal bulbo. E 'una buona idea per tenere varie lampadine di ricambio a portata di mano.
L'identificazione di mutanti e sostanze chimiche che alterano la durata della vita negli eucarioti semplice è stato una forza trainante nella ricerca sull'invecchiamento nel corso degli ultimi anni. Di particolare interesse sono gli interventi che l'invecchiamento lento tra le specie evolutivamente divergenti. La metodologia cronologico vita qui descritta ha contribuito alla nostra comprensione dei meccanismi di base di invecchiamento nel lievito e l'individuazione dei fattori di longevità romanzo che può rivelarsi utile come bersagli terapeutici per il trattamento delle patologie associate all'età nelle persone.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH di Grant 1R21AG031965-01A1. MK è una Ellison Medical Foundation Scholar Nuove invecchiamento.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | Reagent | BD Biosciences | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | Reagent | BD Biosciences | 288620 | |
| Difco Agar | Reagent | BD Biosciences | 214530 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S. | Reagent | MidSci | J630-500G | |
| Amino Acids | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Ammonium Sulfate | Reagent | Spectrum | AM185 | |
| Dextrose | Reagent | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Bioscreen C MBR machine | Tool | Growth Curves USA | 5101370 | |
| Bioscreen 100-well Honeycomb plate | Tool | Growth Curves USA | 9502550 |
References
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).
- Kaeberlein, M. Handbook of models for human aging. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109 (2006).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).
- Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast. Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).
- Fabrizio, P., et al. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).
