Summary
효모의 연대순의 노화는 고정 단계에서 시간과 관련된 세포 생존 능력의 상실을 말합니다. 여기 양적 효모 연대기 수명을 결정하는 높은 처리량 방법을 설명합니다.
Abstract
신진 효모
Protocol
1 부 : 노화 문화의 작성
- YEPD 한천 플레이트에 냉동 주식 (1 % 효모 추출물, 2% bacto - 펩톤, 2 %의 한천, 2 % 포도당)에서 관심 스트 리크 변종.
- 30 ˚ C 48 시간 단일 식민지가 나타날 때까지 전지를 품어.
- 테스트 튜브에 YEPD 액체 매체 5 ML (1 % 효모 추출물, 2% bacto - 펩톤, 2 % 포도당)로 하나의 식민지와 예방을 선택하십시오.
- 30 밤새 문화 ˚ C 쉐이크 또는 롤러 드럼을 사용하여 지속적인 교반을 유지하면서. 그로
- 숙박 문화의 50 μL와 합성 전체 (SC) 중간 5 ML (표 1)을 예방. 일반적으로 세 SC 문화는 검사되는 각 변형에 대한 수명 분석 세중의 생물 학적 복제를 제공하기 위해 각 변형에 대한 준비가되어 있습니다.
- 30 문화를 유지 ˚ C 전체 실험 (일반적으로 2 개 이상 주) 대한 롤러 드럼에 대한 끊임없는 동요와 함께.
2 부 : 생존 연령 지점을 촬영
SC 미디어 문화의 두 일 후에, 세포는 정지 단계에서해야하고 나이 지점 첫 촬영 준비가 된 것입니다. 이후 나이 지점은 두 개의 주 최소 2-3 일마다 이동해야합니다. 각 연령 포인트 :
- YEPD 145 μL와 각각 잘 작성하여 접종에 대한 Bioscreen 100 잘 허니콤 접시를 준비합니다. 전용 데이터 분석에 대한 세포 나중에 YEPD과 잘 채워진 적어도 하나를 남겨주십시오.
- 인큐베이터에서 노화 문화를 제거합니다.
- 간단히 와동 문화 중 하나를 누설하지 않도록주의하면서, 허니콤 접시에 주사하는 최초의 문화.
- 혼합 문화의 5 μL를 제거하고 허니콤 판의 첫 우물에 그것을 피펫. 이전과 5 μL 나누어지는을 제거한 후 각 시험관의 입으 불꽃.
- 각 문화에 해당하는 위치를 잘 참고해야되는 각 고령화 문화에 대해이 절차를 반복합니다. 동일한 물론 순위는 전체 실험에 걸쳐 연령 이후의 각 지점에 대해 사용해야합니다.
- 예방 접종이 완료되면 30 ˚ C 배양기에 문화를 교체합니다.
파트 3 : Bioscreen C MBR 시스템을 로딩
- 뚜껑을 리프팅하여 보육의 구획을 노출하고 샘플 트레이 덮개를 제거합니다.
- 샘플 트레이 (하나만 번호판을 읽을 경우 왼쪽 슬롯 사용)에 새로 주사 허니콤 플레이트를 삽입합니다.
- 샘플 트레이 덮개를 교체하고 보육 구획에 뚜껑을 낮추십시오.
- 열전달 유체가 최소 입력 레벨 이상 있는지 확인하십시오. 낮은 경우, 제공되는 열전달 유체로 1000 μL 피펫을 사용하여 더 추가합니다.
- Bioscreen 소프트웨어 "EZExperiment"를 사용하여, Saccharomyces cerevisiae의에 적합한 성장 곡선을 얻으려면 다음 매개 변수를 설정합니다 :
- 샘플 개수 : 미디어 또는 200 우물의 숫자를 입력
- 필터 : 420 - 580nm, 광대역
- 온도 : 30 ˚ C
- 실험 기간 : 1 일, 0 시간, 0초
- 측정 간격 : 30 분
- 떨고 : 연속 떨고에, 하이
- 수치를 시작하려면 "시작"을 클릭하십시오.
4 부 : 데이터 분석
일반적으로, 여섯 나이에 포인트는 두 주 과정을 점령하고 있습니다. 나이 포인트는 일 2, 4, 6, 9, 11, 13에서 찍은 있습니다. 실험 설계 및 테스트중인 종자에 따라서는 나이 점을 더 많거나 적은 자주 또는 2 주 이상 오래 걸릴하는 것이 바람직하다 수 있습니다. 이것은 데이터 분석 훨씬 쉽게되므로 각 노화 문화, 모든 연령 시점에서 같은 잘 위치에 해당하는 그러한 모든 연령 포인트에 대해 같은 순서로 허니콤 판재를로드하는 것이 중요합니다.
- Bioscreen C MBR 시스템의 출력 파일을 구합니다. 소프트웨어 "EZExperiment는"마이크로 소프트 엑셀뿐만 아니라 다른 소프트웨어와 호환되는 탭으로 구분된 파일로 Bioscreen 데이터를 출력합니다. 첫 번째 열에는 프로그램은 어떤 시간에 OD 측정은 Bioscreen 허니콤 플레이트 (그림 1) 각 잘 나타내는 이후 열, 실험 기간 동안 찍은.
- 모든 칼럼에서 첫 번째 OD 읽기를 삭제합니다. 이 독서는 "노이즈"입니다.
- 각 열에있는 모든 OD 값에서 혼자 YEPD와 우물의 OD 값을 빼서하여 데이터를 정상화. 이것은 미디어에 의해 배경 흡광도를 제거합니다.
- 가지의 곡선을 플롯. 곡선은 나이의 기능 (그림 2)로 이동합니다. 예를 들어, 여섯 시간 동안 열 포인트 1 (허니콤 판 잘 1)에서 가지 곡선을하려하여 시간이 지남에 따라 곡선의 독특한 rightward 변화가 있습니다.
- 각 잘 2 일 나이 지점의 성장 반응 속도론에 기반 복제 시간 (δ)을 계산. 공식 복제 시간을 계산하는 데 사용 IS :
OD 1 OD 2 연속 OD 측정 및 t 1과 t 2 측정 사이의 시간을 대표하는 곳. 0.5-0.2의 OD 값 사이의 시간만을 배로 계산합니다. 이러한 가치의 평균은 잘 대해 배로 시간입니다. 0.5-0.2의 OD 값 사이의 시간만을 배로 계산합니다. 이러한 가치의 평균은 잘 대해 배로 시간입니다. 대부분의 야생 형 효모 계통 85~90분 사이의 복제 시간 값을 제공해야합니다. - 각 연령 포인트 (2 일) 연령 지점 초기에 상대적으로 가지 곡선의 시간 변화 (Δt) 계산합니다. 이 작업을 수행하는 쉬운 방법은 연령 지점 초기 시대 이후의 각 점 사이에 0.3의 OD에 도달 각에 대해 잘했습니다 시간의 길이의 차이를 결정하는 것입니다. 특정 잘 0.3의 OD에 도달하는 시간은 두 시간 포인트 bracketing OD = 0.3 사이의 시간의 함수로 아까에 해당하는 선형 회귀 방정식 (OD)에서 계산하실 수 있습니다.
- 생존 곡선 (그림 3)를 생성하기 위해서는 각 연령 시점에서 살아남은 소수를 계산합니다. 100 % 생존하는 최초의 세 점 (2 일)을 정의합니다. 세 점 각각의 연속에 대한 방정식을 사용하여 %의 생존을 계산 :
S n은 생존 비율이고, Δt n은 시간 근무이며, δ n은 복제 시간입니다. - 시대의 함수로 가능한 세포의 분율 (또는 퍼센트)하려하여 생존 곡선 (그림 3B)로 각각 잘 (또는 복제 웰스)을 원하는를 생성합니다.
- 각 잘 대해 생존을 통합 (SI)를 계산합니다. SI는 생존 곡선 아래의 면적으로 정의되며 수식으로 추정 수 있습니다 :
어디 연령 n은 세 점 (예 : 2, 4, 6, 9, 11, 13)이며 S N 그 연령 시점에서 생존의 가치입니다. - SI 및 생존 데이터 복제 웰스의 통계적 매개 변수를 확인합니다. 관심 일반 통계 매개 변수는 말은, 중간, 그리고 복제 생물의 각 집합에 대한 편차를 포함합니다. T - 테스트 또는 유사한 분석은 다른 실험 및 제어 그룹에 대한 SI의 pairwise 비교에 사용될 수 있습니다. 그것은 또한 생물학은 복제 평균에서 4.8에 설명되어있는 생존 곡선을 생성하는 것이 바람직하다 수 있습니다.
제 5 부 : 대표 결과
실험의 완료에, 당신은 여러 가지 변종이나 조건에 대한 연대기 노화 가능성을 결정하기 위해 충분한 생존 곡선 및 수행 데이터 분석을 해본 것입니다. 제대로 수행한 경우, Bioscreen C MBR 시스템에서 얻은 성장 곡선은 그림 2에 표시된 것과 비슷하게해야하고 그 결과 생존 곡선은 그림 3과 같이 사람과 유사합니다. 일반적으로, 여기에서 설명한 조건 교양 야생 형 전지 7 일의 순서에 중간 연대기의 수명을해야합니다. 생존에 상당한 변화가 다른 변종과 같은 0.05 % 포도당 미디어의 성장과 같은 몇 가지 조건 하에서 관찰이며, 평균 생존은 30 일 초과할 수 있습니다.
Bioscreen 프로그램 "EZExperiment"에서 그림 1. 데이터 출력. 열 A는 흡광도 읽기가 찍은되는 시간을 표시합니다. 연속 열은 노화 문화에서 가져온 세포와 주사 허니콤 접시의 우물을 나타냅니다.
그림 2. 실험 과정을 통해 하나의 생물 학적 복제에서 가지 곡선. 노화 문화에 세포가 생존을 잃게으로 시간이 지남에 따라 곡선에 뚜렷한 변화가 있습니다. 초기 시점 (2 일)와 연속 시점 사이의 시간은 특정 나이에 생존을 결정합니다.
그림 3. A) 그림 1에서 가지 데이터를 사용하여 생성 생존 곡선. 2 일 시점은 100 % 생존 지점으로 설정됩니다. B) 2 계통의 최종 생존 곡선이 같은 실험에서 테스트. 이러한 생존 곡선은 생물 각 변형에 대한 복제 세 평균 viabilities을 나타냅니다. 오류 막대는 생물은 복제 시간 표준 편차를 나타냅니다. 생존 곡선 아래에있는 회색 영역은 스트레인 1 생존 통합 (SI)를 나타냅니다.
| 표 1. 연대순 노화 연구에 사용 합성 정의된 중간 (변형 backgrouND BY4743) | |
| 구성 요소 | 농도 (g / L) |
| D - 글루코오스 | 20 |
| 효모 질소베이스 (-AA/AS) | 1.7 |
| (NH 4) 2 SO 4 | 5.0 |
| 아데닌 | 0.04 |
| L - 아르기닌 | 0.02 |
| L - Aspartic 수 소산 | 0.1 |
| L - 글루탐산 | 0.1 |
| L - 히스티딘 | 0.1 |
| L - 류신 | 0.3 |
| L - 라이신 | 0.03 |
| L - 메티오닌 | 0.02 |
| L - 페닐알라닌 | 0.05 |
| L - 세린 | 0.375 |
| L - 트레오닌 | 0.2 |
| L - 트립토판 | 0.04 |
| L - 티로신 | 0.03 |
| L - 발린 | 0.15 |
| 유라실 | 0.1 |
참고 :이 제조법은 diploid BY4743 변형에 auxotrophies를 차지하고 있습니다. 아미노산 auxotrophies은 합성 전체 매체 배 최종 농도를 추가하여 보상하여야한다.
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Discussion
여기에서 설명한 높은 처리량 연대기 수명 분석은 높은 정확성과 정밀도와 변종 다수의 고령화 잠재력을 quantifying위한 효과적인 방법입니다. 식민지 - 형성 단위 (예 3 참조) 계산에 의해 생존을 결정하는 고전적인 방법을 통해이 방법의 주요 사전은 높은 해상도의 성장 곡선을 얻기 위해 같은 Bioscreen C MBR 시스템으로 쉐이크 / 보육 / 플레이트 읽기 장치의 사용이다 각 나이 가리 킵니다. 낮은 처리량 연대기 수명의 assays와 직접 비교,이 방법은 크게 4 분석할 수 샘플의 수를 증가하면서 비교 (이상) 정밀도를 달성하기 위해 표시되었습니다.
위에서 설명한 방법은 노화 연구에 대한 일반적으로 사용되는 문화 조건 변경 연대기 장수 유전자 변종을 검사에 적합합니다. 이 방법은 쉽게 다른 문화와 같은 호흡기 성장에 사전 적응 (글리세롤 탄소 소스) 5, 물속에 유지 보수보다는 만료 미디어와 같은 조건, 또는식이 제한 4 연구하지만, 적용할 수 있습니다. 약리 심사 목적으로 적응도 도서관에서 다소 다른 변종을 inoculating보다 노화 언론 매체에 다른 화합물을 추가하여 예를 들어, 구상 수 있습니다.
방법도 여기에 설명된 수명 결정에 사용되는 세 점에 유연성을 제공합니다. 위에서 설명한 바와 같이, 나이 지점은 일 2, 4, 6, 9, 11, 및 실험 13에서 찍은 있습니다. 이 나이 지점 변경 수명과 돌연변이에 대한 효모 ORF 삭제 컬렉션을 검사에 적합하지만, 다른 응용 프로그램, 문화 환경, 또는 유전 배경에 적합하지 않을 수 있습니다. 그것은 여러 실험을 통해하는 경우 비교가 원하는 것을, 그러나 지적해야 나이 지점의 동일한 세트는 각 실험에 사용해야합니다.
연대순 수명 실험을 수행하는 과정에서 우리가 정기적으로 노화 문화에 세포의 일부는 세포주기를 다시 입력 것이라는 지적했습니다 현상 6 '허걱'이라고도합니다. 허걱는 노령화 문화에 가능한 세포의 수를 증가에 대응하는 하나 이상의 나중에 나이 지점에서 가지 곡선의 왼편쪽에 변화로 볼 수 있습니다. 허걱가 발생 문화가 생존 이미 이후의 연령 포인트가 크게 SI에 영향을 미치는 것은 아니라는 점을 충분히 낮은 않는 한, 분석에서 제거되어야합니다.
Bioscreen C MBR 시스템의 정기 점검은 재현성 정확한 장수 데이터를 얻기 위해 필요합니다. 이것은 열 전달 유체가 최소 입력 수준 이상의 유지는 것을 필수적이며, 이것은 컴퓨터에있는 모든 실행하기 전에 확인하여야한다. 허니콤 접시의 지속적인 흔들어 만든 먼지를 제거하는 트레이를 닦고하여 배양 챔버의 내부를 정기적으로 청소를하는 것도 도움이 그것이다. 전구도 한두 번 일년에 교체해야합니다. F1.b2 오류 메시지가 전구에서 빛이 부족을 나타냅니다. 그것은 한편으로는 몇 가지 여분의 전구를 유지하는 것이 좋습니다.
돌연변이 간단한 eukaryotes의 수명을 변경 약품의 식별은 지난 몇 년 동안 노화 연구의 원동력이되었습니다. 특히 관심이 그 개입은 evolutionarily 분기하는 수종에 걸쳐 그 느린 노화 있습니다. 연대순 수명 방법론은 신진 누룩과 궁극적으로 사람 연령 관련 질환 치료를위한 치료 대상으로 유용하게 될 수 있습니다 소설 장수 요인의 식별에 노화의 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해에 공헌했다 여기에서 설명한.
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Acknowledgments
이 작품은 NIH 그랜트 1R21AG031965 - 01A1에 의해 지원되었다. MK는 노화에 엘리슨 의료 재단 신규 장학생입니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | Reagent | BD Biosciences | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | Reagent | BD Biosciences | 288620 | |
| Difco Agar | Reagent | BD Biosciences | 214530 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S. | Reagent | MidSci | J630-500G | |
| Amino Acids | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Ammonium Sulfate | Reagent | Spectrum | AM185 | |
| Dextrose | Reagent | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Bioscreen C MBR machine | Tool | Growth Curves USA | 5101370 | |
| Bioscreen 100-well Honeycomb plate | Tool | Growth Curves USA | 9502550 |
References
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).
- Kaeberlein, M. Handbook of models for human aging. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109 (2006).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).
- Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast. Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).
- Fabrizio, P., et al. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).
