Summary
Maya Kronolojik yaşlanma, sabit faz zaman ile ilişkili hücre canlılığı kaybı anlamına gelmektedir. Burada maya kronolojik ömrü kantitatif olarak belirlenmesi için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Maya
Protocol
Bölüm 1: yaşlanma kültürlerin Hazırlık
- YEPD agar plakları üzerine donmuş stokları (% 1 maya özü,% 2 bacto-pepton,% 2 agar,% 2 glukoz) faiz Streak suşları.
- 30 ˚ C'de 48 saat veya tek koloniler görünene kadar hücrelerin inkübe edin.
- 5 ml (% 1 maya özü,% 2 bacto-pepton,% 2 glukoz) test tüplerinde YEPD sıvı ortamın içine tek koloniler ve inokülasyon seçin.
- Grow 30 geceleme kültürleri ˚ C çalkalayıcı veya rulo davul kullanarak sürekli ajitasyon korurken.
- 50 mcL gecelik kültür sentetik tam (SC) orta (Tablo 1) 5 ml inoküle edin. Genellikle üç SC kültürler incelendiğinde her bir suş için üç nüsha ömrü analiz biyolojik çoğaltma sağlamak için her bir suş için hazırlanmıştır.
- 30 kültürlerin koruyun ˚ C (genellikle 2 veya daha fazla hafta) tüm deney için silindir tambur üzerinde sabit ajitasyon.
Bölüm 2: bir canlılığı yaş noktası alarak
SC medya kültürünün iki gün sonra, hücreler sabit faz olmalı ve ilk yaş noktası alınacak hazırdır. Daha sonraki yaş-iki hafta en az 2-3 gün her gün alınmalıdır. Her yaş noktası için:
- YEPD 145 mcL her kuyu doldurarak aşılama için Bioscreen 100-iyi Petek tabak hazırlayın. Sadece veri analizi için hiçbir hücre sonra YEPD ve en az bir sıra dolu bıraktığınızdan emin olun.
- Inkübatör yaşlanma kültürler çıkarın.
- Kısaca vorteks kültürünün herhangi bir dökmemeye dikkat ederek, Petek plaka inoküle ilk kültür.
- Karışık kültür 5 mcL çıkarın ve Petek plaka ilk kuyuya pipetle. 5 mcL kısım çıkarmadan önce ve sonra her bir test tüpünde ağız Alev.
- Her yaşlanma kültür her kültüre uygun iyi bir konuma dikkat emin olmak için bu yordamı tekrarlayın. Özdeş iyi pozisyonlar tüm deney boyunca nokta sonraki her yaş için kullanılmalıdır.
- 30 ˚ C inkübatör içine kültürleri aşılar bittiğinde değiştirin.
Bölüm 3: Bioscreen C MBR makine yükleme
- Inkübatör bölmesi kapağı kaldırarak teşhir etmek ve örnek tepsisi kapağı çıkarın.
- Yeni inoküle Petek plaka örnek tepsi (tek bir plaka okuma, soldaki yuvanın) içine yerleştirin.
- Örnek tepsi kapağını değiştirin ve inkübatör bölmesi kapağı düşük.
- Isı transfer akışkanı minimum dolum seviyesi üzerinde olduğundan emin olmak için kontrol edin. Düşük, sağlanan ısı transferi sıvısı ile 1000 mcL pipet kullanarak daha fazla eklemek.
- "EZExperiment" Bioscreen yazılım kullanarak, Saccharomyces cerevisiae için uygun büyüme eğrileri elde etmek için aşağıdaki parametreleri ayarlayın:
- Numune sayısı: medya ya da 200 kuyu sayısını girin
- Filtre: 420-580nm, Geniş Bant
- Sıcaklık: 30 ˚ C
- Deneme Uzunluğu: 1 Gün, 0 saat, 0 saniye
- Ölçüm Aralığı: 30 dakika
- Çalkalamalı, Sürekli sallayarak, Yüksek
- Okuma başlamak için "Başlat" düğmesini tıklayın.
Bölüm 4: Veri Analizi
Genellikle iki hafta boyunca, altı yaş noktaları alınır. Gün 2, 4, 6, 9, 11 ve 13 yaş noktaları alınır. Deneysel tasarım ve test edilen suşların bağlı olarak, yaş puan daha fazla veya daha az sıklıkla veya 2 haftadan daha uzun süre almak için istenebilir. Bu veri analizi çok daha kolay hale getirecek her yaşlanma kültür, her yaş noktada aynı iyi konumuna karşılık geldiği gibi, her yaş noktası için aynı sırayla Petek plaka yüklemek için önemlidir.
- Bioscreen C MBR makineden çıktı dosyalarını alın. "EZExperiment" yazılım, Microsoft Excel gibi diğer yazılımları ile uyumlu bir sekme ile sınırlandırılmış dosya olarak Bioscreen veri çıkışı. Ilk sütun gösterir OD ölçümü ne zaman Bioscreen Petek levhalar (Şekil 1) Her iyi temsil sonraki sütunlar, deney sırasında çekildi.
- Her sütundaki ilk OD okuma silin. Bu okuma "gürültü".
- Her sütunun tüm OD değerleri yalnız YEPD iyi OD değeri çıkarılarak veri Normale. Bu medya tarafından arka plan absorbans kaldırır.
- Akıbet eğrileri çizilir. Eğrileri, yaş bir fonksiyonu (Şekil 2) olarak kayacak. Örneğin, altı kez puan üzerinden sütun 1 (Petek plaka 1) akıbet eğrilerinin çizilmesi, zamanla eğrilerin ayrı bir sağa kayma var.
- Her gün 2 yaş noktası büyüme kinetiği dayalı katlama süresi (δ) hesaplayın. Denklemin iki katına zaman hesaplamak için kullanılan as:
OD 1 ve OD 2 ardışık OD ölçümleri ve t 1 ve t 2 ölçümler arasındaki zaman temsil nerede. 0,5 OD değerleri arasında 0.2 kat, sadece iki katına hesaplayın. Bu değerlerin ortalaması çok iyi iki katına zaman. 0,5 OD değerleri arasında 0.2 kat, sadece iki katına hesaplayın. Bu değerlerin ortalaması çok iyi iki katına zaman. Çoğu yabani tip maya suşları iki katına çıkma süresi 85 ila 90 dakika arasında bir değer vermek gerekir. - Her yaş noktası için, yaş başlangıç noktası (2 gün) göre akıbet virajlarda zaman kaydırma (¨ t) hesaplar. Bunu yapmanın kolay bir yolu, yaş noktası ilk ve sonraki her yaş noktası arasındaki 0.3 OD ulaşmak için her bir kuyu için aldı süresini farkı belirlemek için. Ln karşılık gelen lineer regresyon denklemini (OD) belirli bir sıra 0.3 OD ulaştığı zaman, iki zaman noktaları braketi OD = 0.3 arasındaki zamanın bir fonksiyonu olarak hesaplanabilir.
- Sağkalım eğrisi Şekil 3. üretmek için her yaş noktası hayatta kesir hesapla. % 100 canlılığı ilk yaş noktası (2 gün) tanımlayın. Birbirini izleyen her yaş noktası için denklem kullanılarak yüzde hayatta kalma hesaplayın:
s n hayatta kalma yüzdesi, ¨ t n zaman kaydırma ve δ n katlama süresi . - Yaş bir fonksiyonu olarak canlı hücrelerin fraksiyonu (veya yüzde) planlamakla sağkalım eğrileri (Şekil 3B) olarak her iyi (veya çoğaltmak kuyu) için istenen oluşturun.
- Her bir kuyu için hayatta kalma ayrılmaz (SI) hesaplayın. SI hayatta kalma eğrisi altında kalan alan olarak tanımlanır ve formül ile tahmin edilebilir:
nerede yaş n yaş noktası (örneğin 2, 4, 6, 9, 11, ve 13) ve s n bu yaş noktada hayatta kalma değerdir . - SI ve sağkalım verileri çoğaltmak kuyuların istatistiksel parametreler belirleyin. Ortak ilgi istatistiksel parametreleri ortalama, medyan, ve her set biyolojik çoğaltır için varyans içerir. Bir t-testi ya da benzeri analiz SI farklı deney ve kontrol grupları için ikili karşılaştırma için kullanılabilir. Aynı zamanda biyolojik çoğaltır ortalama 4,8 olarak açıklanan sağkalım eğrileri oluşturmak için istenebilir.
Bölüm 5: Temsilci sonuçları
Deney bitiminde, birkaç farklı suşları veya koşullar için kronolojik yaşlanma potansiyelini belirlemek için yeterli sağkalım eğrisi ve yapılan veri analizi çizilen olacaktır. Eğer düzgün bir şekilde gerçekleştirilir, Bioscreen C MBR makine elde edilen büyüme eğrileri Şekil 2'de gösterildiği gibi benzer görünmelidir ve sağkalım eğrileri Şekil 3'te gösterildiği gibi olmalıdır. Genel olarak, burada açıklanan koşullar altında kültür yabani tip hücrelerin 7 gün sipariş üzerine medyan kronolojik ömrü olacak. Farklı suşları ve% 0.05 glukoz medya büyüme gibi bazı koşullar altında hayatta kalma arasında önemli farklılıklar görülmektedir, medyan sağkalım 30 gün aşabilir.
Bioscreen programı "EZExperiment" Şekil 1. Veri çıkışı. Sütun absorbans okuma alındığı zaman görüntüler. Ardışık sütunlar yaşlanma kültürleri alınan hücreleri ile inoküle Petek plaka kuyulardan temsil eder.
Şekil 2 bir deney boyunca tek bir biyolojik çoğaltıldıktan sonucudur eğrileri. Yaşlanma kültür hücreleri canlılığını kaybettiği zamanla eğrileri belirgin bir değişim vardır. Başlangıç noktası (2 gün) ve ardışık bir zaman noktası arasındaki zaman uzunluğu, o belirli bir yaşta canlılığı belirler.
Şekil 3. A) Şekil 1 akıbet verileri kullanılarak oluşturulan bir sağkalım eğrisi. Gün 2 zaman noktası% 100 canlılığı noktası olarak ayarlanır. B) iki suşunun Nihai sağkalım eğrileri aynı deneyi test. Bu sağkalım eğrileri, biyolojik ve her bir suş için çoğaltır üç ortalama canlılığı temsil eder. Hata çubukları biyolojik çoğaltır içinde standart sapmasını temsil eder. Sağkalım eğrisi altında gölgeli alanda 1 suşu için hayatta kalma ayrılmaz (SI) temsil eder.
| Tablo 1. Kronolojik Yaşlanma Araştırmaları kullanılır Sentetik Tanımlı Orta (suşu background BY4743) | |
| Bileşen | Konsantrasyon (g / L) |
| D-glukoz | 20 |
| Maya azot taban (-AA/AS) | 1,7 |
| (NH 4) 2 SO 4 | 5,0 |
| Adenin | 0,04 |
| L-Arginin | 0,02 |
| L-Aspartik asit | 0,1 |
| L-Glutamik asit | 0,1 |
| L-Histidin | 0,1 |
| L-Leucine | 0,3 |
| L-Lizin | 0,03 |
| L-Methionine | 0,02 |
| L-Fenilalanin | 0,05 |
| L-Serine | 0,375 |
| L-Threonine | 0,2 |
| L-Triptofan | 0,04 |
| L-Tyrosine | 0,03 |
| L-Valin | 0,15 |
| Urasil | 0,1 |
Not: Bu tarif diploid BY4743 suşu auxotrophies için hesaplar. Amino asit auxotrophies sentetik tam orta 5X bir final konsantrasyon ekleyerek telafi edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yüksek verim kronolojik ömrü tahlil, yaşlanma, yüksek doğruluk ve hassasiyet ile suşlarının çok sayıda potansiyel ölçülmesi için etkili bir yöntemdir. Bu yöntemin birincil önceden koloni oluşturan birim (örneğin 3 görmek) sayarak hayatta kalma belirlenmesi için klasik yöntemleri üzerinde, yüksek çözünürlüklü büyüme eğrileri elde etmek için bu Bioscreen C MBR makine olarak bir çalkalayıcı / inkübatör / plaka okuma cihazı kullanımı Her yaş noktası. Düşük verimlilik kronolojik ömrü testleri ile doğrudan karşılaştırıldığında, bu yöntem 4 analiz edilecek örneklerin sayısını önemli ölçüde artırırken, karşılaştırılabilir (veya daha iyisi) hassasiyeti elde gösterilmiştir .
Yukarıda açıklandığı gibi yöntem değişmiş kronolojik yaşlanma çalışmaları için yaygın olarak kullanılan kültür koşulları altında uzun ömür için genetik varyantlar tarama için uygundur. Bu yöntem, alternatif kültür solunum büyüme ön-adaptasyon (gliserol karbon kaynağı) 5, su bakım yerine aşımına uğramış ortam gibi koşulları, ya da diyet kısıtlaması 4 çalışmaları için kolay, ancak, adapte olabilir . Farmakolojik tarama amaçlı adaptasyonu da örneğin bir kütüphane farklı suşları aşılamak yerine yaşlanma medya için farklı kimyasal bileşikler ekleyerek, tasavvur edilebilir.
Bu yöntem aynı zamanda burada açıklanan ömrünün belirlenmesi için kullanılan yaş noktaları esneklik sağlar. Yukarıda açıklandığı gibi, yaş noktaları gün 2, 4, 6, 9, 11 ve 13 deney alınır. Bu yaş maya ORF silme toplama değişmiş ömrü olan mutantlar için tarama için uygundur, ancak diğer uygulamalar, kültür koşulları, ya da genetik geçmişleri için uygun olmayabilir. Ancak, birden fazla deneyler arasında karşılaştırma istenilen olduğunu kaydetti olmalı, aynı yaş puan, her bir deney için kullanılmalıdır.
Kronolojik ömrü deneyler sırasında, hücrelerin yaşlanma kültürünün bir alt kümesi periyodik olarak hücre döngüsü yeniden girecek dikkat, bir fenomen, 6 'nefes nefese' olarak anılacaktır . Nefes nefese yaşlanma kültürü canlı hücrelerinin sayısında artışa karşılık gelen bir veya daha fazla ileri yaşlardaki noktaları akıbet eğrisi sola doğru bir kayma olarak görülebilir. Nefes nefese meydana Kültürler canlılığı sonraki yaş noktaları SI önemli ölçüde etkisi olmayacağı zaten yeterince düşük olmadığı sürece, analiz çıkarılmalıdır.
Bioscreen C MBR makinenin rutin bakım, tekrarlanabilir ve doğru uzun ömürlü veri elde etmek için gerekli. Isı transfer akışkanı minimum dolum seviyesi üzerinde tutulması esastır ve bu makine üzerinde her çalıştırmadan önce kontrol edilmelidir. Petek plakaların sürekli sallayarak oluşturulan toz kaldırmak için tepsiyi silme kuluçka odasının iç periyodik olarak temizlemek için de yararlı olur. Ampul de bir veya iki kez bir yıl değiştirilmesi gerekir. F1.b2 bir hata mesajı ampul yetersiz ışık gösterir. Birkaç yedek ampuller elle tutmak iyi bir fikirdir.
Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, mutantlar ve basit ökaryotlarda ömrü değiştiren kimyasallar kimlik yaşlanma araştırma itici güç olmuştur. Özellikle ilgi çekici olan bu müdahaleler evrimsel birbirinden farklı türler arasında yaşlanmayı yavaşlatır. Burada anlatılan kronolojik ömrü metodolojisi tomurcuklanan maya ve sonuçta insanların yaşa bağlı hastalıkların tedavisi için terapötik hedef olarak yararlı olabilir romanı uzun ömürlü faktörlerin belirlenmesi, yaşlanmanın temel mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Hibe 1R21AG031965-01A1 tarafından desteklenen oldu. MK Yaşlanma Ellison Tıp Vakfı Yeni Scholar.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | Reagent | BD Biosciences | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | Reagent | BD Biosciences | 288620 | |
| Difco Agar | Reagent | BD Biosciences | 214530 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S. | Reagent | MidSci | J630-500G | |
| Amino Acids | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Ammonium Sulfate | Reagent | Spectrum | AM185 | |
| Dextrose | Reagent | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Bioscreen C MBR machine | Tool | Growth Curves USA | 5101370 | |
| Bioscreen 100-well Honeycomb plate | Tool | Growth Curves USA | 9502550 |
References
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).
- Kaeberlein, M. Handbook of models for human aging. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109 (2006).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).
- Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast. Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).
- Fabrizio, P., et al. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).
