Summary
बाँझ शर्तों के तहत Gibberella zeae, संग्रह के लिए एक प्रक्रिया में ascospores के विकास की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए आदेश में प्रोटोकॉल विवरण के लिए जानकारी का उच्चतम स्तर उत्पन्न फिल्माया है. यह प्रयोग, एक महत्वपूर्ण पहलू है जब पूर्ण जीनोम अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल परीक्षण लागू कर रहे हैं के reproducibility की सुविधा चाहिए.
Abstract
Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) एक संयंत्र रोगज़नक़ गेहूं और जौ कि फसल की उपज और अनाज की गुणवत्ता को कम कर देता है पर पपड़ी रोग के कारण है. एफ graminearum भी मक्के का डंठल और कान rots का कारण बनता है और trichothecenes कि अनाज दूषित और मनुष्यों और पशुओं (गोस्वामी और Kistler, 2004) के लिए हानिकारक हैं जैसे mycotoxins के एक निर्माता है. कवक spores के दो प्रकार के उत्पादन करता है. Ascospores, प्रजनक, यौन प्रजनन से उत्पन्न प्राथमिक संक्रमण का मुख्य स्रोत हैं. ये spores जबरन परिपक्व perithecia से छुट्टी कर रहे हैं और हवा (+१,९९९ Francl एट अल) के द्वारा छितरी हुई है. माध्यमिक संक्रमण मुख्य रूप से macroconidia जो संयंत्र सतह पर अलैंगिक मतलब द्वारा उत्पादित कर रहे हैं की वजह से कर रहे हैं. इस कवक में ascospores के विकास की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, बाँझ शर्तों के तहत बड़ी मात्रा में अपने संग्रह के लिए एक प्रक्रिया की आवश्यकता थी. हमारी प्रोटोकॉल क्रम में करने के लिए समझ और reproducibility के लिए जानकारी का उच्चतम स्तर उत्पन्न फिल्माया गया था, महत्वपूर्ण पहलुओं जब पूर्ण जीनोम जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल उत्पन्न होते हैं और व्याख्या. विशेष रूप से, ascospore अंकुरण और जैविक गतिविधि की परिवर्तनशीलता सामग्री की पूर्व हेरफेर पर निर्भर हैं. ascospore उत्पादन में हर कदम का दस्तावेजीकरण करने के लिए वीडियो का उपयोग क्रम में मानकीकरण में वृद्धि का प्रस्ताव है, माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए तेजी से कड़े आवश्यकताओं के साथ पालन. प्रक्रिया केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है. चरण संदूषण और एहसान ascospores के समय तुल्यकालन को रोकने के लिए दिखाए जाते हैं.
Protocol
- गाजर अगर (Klittich और Leslie, 1988) 9 सेमी व्यास पेट्री डिश में तैयार किया गया था.
- अगर ताजा आलू dextrose अगर पर हो mycelium युक्त के 2 मिमी घन प्रत्येक पेट्री डिश के केंद्र के लिए लागू किया गया था.
- संस्कृतियों 25 में बड़े हो रहे थे डिग्री सेल्सियस और एक 12 घंटे 96 बजे के लिए photoperiod.
- संस्कृति की सतह (ट्रेल और 2000 आम,) जलीय 2.5% के बीच 60 का एक मिलीलीटर लागू किया गया था और संस्कृति भर में फैले एक प्लास्टिक की छड़ी के साथ धीरे दबाकर.
- Perithecia शूटिंग इस प्रेरण उपचार के बाद 7-10 दिनों विकसित ascospores जब 25 डिग्री सेल्सियस के एक उच्च नमी के वातावरण में एक ही photoperiod के साथ रखा.
- बीजाणु संग्रह पेट्री प्लेट ढक्कन बदलते द्वारा किया जाता है, perithecia अंधेरे में एक सीमित समय (उदाहरण के लिए 12 घंटे) के लिए शूट करने के लिए छोड़ने.
- बाँझ पानी ढकने के लिए जोड़ा जाता है, धीरे सतह पर पानी हिल द्वारा ascospores निलंबित.
- Ascospores बाँझ फाल्कन ट्यूबों में एकत्र कर रहे हैं, धोया और आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पिछले Fusarium एसपीपी के लिए perithecial उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं पर आधारित है. (Klittich और Leslie, 1988, ट्रेल और 2000 के आम,). प्रक्रिया है जिसके द्वारा ascospores (माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए पर्याप्त) की बड़ी मात्रा में उत्पन्न किया गया के मानकीकरण प्रयोग के reproducibility के लिए आवश्यक था. यह बताया गया है कि पर्यावरणीय कारकों, उम्र, और सब्सट्रेट मतभेद ascospores के जैविक चरित्र (बेयर और Verreet, 2005) बदल सकते हैं. इसलिए वीडियो का उपयोग तरह spores उत्पादन और एकत्र कर रहे हैं कि reproducibility को सुविधाजनक बनाने चाहिए में छोटे विवरण को उजागर कर सकते हैं. विशेष रूप से प्रक्रिया के वीडियो प्रयोगशालाओं के बीच मानकीकरण के स्तर में सुधार लाने और पूरे जीनोम प्रतिलेखन अध्ययन है जो ascospore उत्पादन की आवश्यकता की तुलना की सुविधा चाहिए. शाही सेना के प्रयोग की प्रक्रिया के लिए आवश्यक राशि अपेक्षाकृत उच्च है तो पेट्री डिश की एक बड़ी संख्या synchronously संसाधित किया जाना चाहिए. वीडियो एक विशेष रूप से उपयुक्त उपकरण है जब यह करने के लिए नई जैविक सामग्री पर पूरे जीनोम transcriptional अध्ययन को लागू करने के लिए आवश्यक है, भविष्य के प्रयोगों के लिए एक मानक स्थापित.
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Acknowledgments
लेखकों और उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए करेन Hilburn धन्यवाद. इस परियोजना के USDA सहकारी राज्य अनुसंधान, शिक्षा और विस्तार सेवा (2004-35604-14327 # पुरस्कार) के राष्ट्रीय अनुसंधान पहल द्वारा समर्थित किया गया था. Matias Pasquali ब्रैंको Weiss फैलोशिप द्वारा समर्थित है. अमेरिकी गेहूं और जौ पपड़ी पहल भी अनुसंधान के सतत समर्थन के लिए स्वीकार किया है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish 9 cm diameter | Tool | |||
| Tween 60 (20%) | Reagent | |||
| Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) | Reagent |
References
- Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. , (2005).
- Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. , (1999).
- Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. , (2004).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
- Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. , (2000).
- Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. , 67-1101 (1975).
- Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. , (1976).
