Summary
Per studiare i processi di sviluppo delle ascospore in Gibberella zeae, una procedura per la raccolta in condizioni di sterilità è girato in modo da generare il massimo livello di informazioni per la descrizione del protocollo. Ciò dovrebbe facilitare la riproducibilità dell'esperimento, un aspetto cruciale quando è piena genoma test profilo di espressione attuazione.
Abstract
Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) è un patogeno per le piante che causano la malattia crosta di grano e orzo, che riduce la qualità e la resa delle colture di grano. F. graminearum causa anche marcisce stelo e spiga di mais ed è un produttore di micotossine, quali i tricoteceni che contaminano cereali e sono nocivi per gli esseri umani e animali (Goswami e Kistler, 2004). Il fungo produce due tipi di spore. Ascospore, i propaguli che derivi dalla riproduzione sessuale, sono la principale fonte di infezione primaria. Queste spore sono forzatamente dimessi periteci maturi e disperse dal vento (Francl et al 1999). Infezioni secondarie sono principalmente causati da macroconidia che sono prodotte per mezzo asessuata sulla superficie della pianta. Per studiare i processi di sviluppo di ascospore in questo fungo, una procedura per la loro raccolta in grande quantità in condizioni di sterilità è stato richiesto. Il nostro protocollo è stato filmato in modo da generare il massimo livello di informazione per la comprensione e la riproducibilità; aspetti cruciali quando è piena genoma profili di espressione genica sono generati e interpretati. In particolare, la variabilità di germinazione ascospore e l'attività biologica dipendono dalla prima manipolazione del materiale. L'uso del video per documentare ogni fase di produzione ascospore viene proposto al fine di aumentare la standardizzazione, conformi ai requisiti sempre più stringenti per l'analisi microarray. La procedura richiede solo equipaggiamento standard di laboratorio. Passaggi sono illustrati per impedire la contaminazione e tempo di sincronizzazione favore di ascospore.
Protocol
- Agar carota (Klittich e Leslie, 1988) è stato preparato in piatti di diametro 9 cm di Petri.
- Un cubo 2 mm di agar contenente micelio freschi coltivati su agar patata destrosio è stato applicato al centro di ogni piatto di Petri.
- Le culture sono state coltivate a 25 ° C e una 12-ore fotoperiodo di 96 ore.
- Un ml di soluzione acquosa 2,5% Tween 60 è stata applicata sulla superficie della cultura (Trail e Common, 2000) e diffuse in tutta la cultura con una bacchetta di plastica, premendo delicatamente.
- Riprese periteci ascospore sviluppato 7-10 giorni dopo questo trattamento di induzione, conservato in un ambiente alto tasso di umidità a 25 ° C con il fotoperiodo stesso.
- Spore raccolta viene eseguita modificando il coperchio della piastra Petri, lasciando periteci di girare per un tempo limitato (per esempio 12 ore) al buio.
- Acqua sterile è aggiunto il coperchio, sospendendo ascospore delicatamente movimento dell'acqua in superficie.
- Ascospore sono raccolti in provette sterili Falcon, lavati e utilizzati per ulteriori analisi.
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Discussion
Il protocollo qui presentata si basa su precedenti procedure utilizzate per la produzione di perithecial per Fusarium spp. (Klittich e Leslie, 1988; Trail e Common, 2000). Standardizzazione della procedura con la quale sono state generate grandi quantità di ascospore (sufficiente per l'analisi microarray) è stato essenziale per la riproducibilità dell'esperimento. E 'stato riportato che le differenze i fattori ambientali, età e substrato può cambiare il carattere biologico delle ascospore (Beyer e Verreet, 2005). Pertanto l'uso di video può evidenziare piccoli dettagli nel modo in cui vengono prodotte le spore e raccolti che dovrebbe facilitare la riproducibilità. In particolare il video della procedura dovrebbe migliorare il livello di standardizzazione tra i laboratori e facilitare il confronto di studi di tutto trascrizione del genoma che richiedono la produzione ascospore. La quantità di RNA necessari per la procedura di esperimento è relativamente alta per cui un gran numero di piastra di Petri devono essere elaborati in modo sincrono. Il video è uno strumento particolarmente adatto quando è necessario implementare studi intero genoma di trascrizione sul nuovo materiale biologico, stabilendo uno standard per gli esperimenti futuri.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano Karen Hilburn per un eccellente supporto tecnico. Questo progetto è stato sostenuto dal National Research Initiative dello Stato USDA cooperativa ricerca, istruzione e servizi di estensione (Premio # 2004-35604-14327). Matias Pasquali è supportato da Branco Weiss Fellowship. Il grano statunitense e Scab Iniziativa L'orzo è anche riconosciuto per il continuo sostegno della ricerca.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish 9 cm diameter | Tool | |||
| Tween 60 (20%) | Reagent | |||
| Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) | Reagent |
References
- Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. , (2005).
- Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. , (1999).
- Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. , (2004).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
- Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. , (2000).
- Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. , 67-1101 (1975).
- Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. , (1976).
