Summary
Steril koşullar altında toplanması için bir prosedür Gibberella zeae ascospores gelişim süreçleri incelemek için en üst düzeyde protokol açıklamasına bilgi üretmek için filme. Bu deney, çok önemli bir yönü tam genom ekspresyon profil testleri uygulanmaktadır tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak gerekir.
Abstract
Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) kırpma verim ve tahıl kalitesini azaltır arpa buğday ve uyuz hastalığı yol açan bir bitki patojen. F. graminearum ayrıca mısır sapı ve kulak çürür nedenleri ve mikotoksinler gibi tahıl kirletecek ve insan ve hayvan (Goswami ve Kistler, 2004) zararlı trichothecenes gibi bir yapımcı. Mantar iki tür sporlar üretir. Ascospores, eşeyli üreme sonucu propagules, birincil enfeksiyon ana kaynağıdır. Bu sporlar zorla olgun perithecia taburcu ve rüzgar (Francl ve ark 1999) tarafından dağıtıldı. İkincil enfeksiyonlar özellikle macroconidia bitki yüzeyinde aseksüel yoluyla üretilmektedir kaynaklanır. Bu mantar ascospores gelişim süreçlerini incelemek için, steril koşullar altında büyük miktarda toplanması için bir prosedür gerekli oldu. Tam genom gen ekspresyon profilleri oluşturulur ve yorumlanır önemli yönleri; protokol anlayış ve tekrarlanabilirlik için en üst düzeyde bilgi üretmek için çekildi. Özellikle, ascospore çimlenme ve biyolojik aktivite değişkenlik malzeme önceden manipülasyon bağlıdır. Mikroarray analizi için giderek daha sıkı şartlara uygun standardizasyon artırmak amacıyla ascospore üretiminde her adım belgeleyen video kullanımı önerilmiştir. Bu prosedür, sadece standart laboratuar ekipmanları gerektirir. Adımlar kontaminasyon ve ascospores lehine zaman senkronizasyonu önlediği gösterilmiştir.
Protocol
- Havuç agar (Klittich ve Leslie, 1988) 9 cm çaplı Petri kutularına hazırlanmıştır.
- 2 mm küp patates dekstroz agar yetişen taze misel içeren agar her Petri kabı merkezine uygulanmıştır.
- Kültürler 25 büyüdü ° C ve 96 saat için 12 saat fotoperiyodun.
- Sulu% 2.5 Tween 60 ml plastik bir çubuk ile hafifçe basarak, kültürün yüzey (Yol ve Ortak, 2000) uygulanmış ve kültür yayılmış.
- Aynı fotoperiyodun ile 25 ° C'de yüksek nemli ortamlarda muhafaza Perithecia çekim ascospores Bu indüksiyon tedavisinden sonra 7-10 gün geliştirdi.
- Spore toplama perithecia sınırlı bir süre için (örneğin 12 saat) karanlıkta ateş bırakarak Petri plaka kapağını değiştirerek yapılır.
- Steril su yüzeyinde su hafifçe hareket ettirerek ascospores askıya kapağı eklenir.
- Ascospores, steril Falcon tüpler toplanır, yıkanır ve daha fazla analiz için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol, önceki prosedürleri Fusarium spp perithecial üretimi için kullanılan dayanmaktadır. (Klittich ve Leslie, 1988; Yol ve Ortak, 2000). Ascospores büyük miktarlarda (mikroarray analizi için yeterli) üretildi hangi prosedürün Standardizasyon tekrarlanabilirlik deney için gerekli idi. Bu çevresel faktörler, yaş ve yüzey farklılıkları biyolojik karakter ascospores (Beyer ve Verreet, 2005) değiştirebilirsiniz bildirilmiştir. Bu nedenle video tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak gereken sporlar ürettiği ve topladığı şekilde küçük ayrıntıları vurgulamak. Özellikle prosedürün video laboratuarlar arasında standardizasyon düzeyini yükseltmek ve ascospore üretim gerektiren tüm genom transkripsiyon çalışmaları karşılaştırma kolaylaştırmak gerekir. Petri kabı, çok sayıda eşzamanlı olarak işlenecek, bu yüzden deney prosedürü için gerekli olan RNA miktarı oldukça yüksektir. Gelecek deneyler için standart bir ayar, yeni biyolojik malzeme tüm genom transkripsiyonel çalışmaları uygulamak için gerekli olduğunda, Video, özellikle uygun bir araç.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar Karen Hilburn mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu proje, USDA Kooperatifi Devlet Araştırma, Eğitim ve Yayım Hizmetleri (Ödül # 2004-35604-14327) Ulusal Araştırma Girişimi tarafından desteklenmiştir. Matias Pasquali Branco Weiss Kardeşliği tarafından desteklenmektedir. ABD Buğday ve Arpa Kışır Girişimi de devam eden araştırma desteği için kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish 9 cm diameter | Tool | |||
| Tween 60 (20%) | Reagent | |||
| Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) | Reagent |
References
- Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. , (2005).
- Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. , (1999).
- Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. , (2004).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
- Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. , (2000).
- Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. , 67-1101 (1975).
- Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. , (1976).
