Biology

كبيرة الحجم (20L +) الترشيح لعينة من ماء البحر الساحلية

Published: June 18, 2009 doi: 10.3791/1161

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

هذا الكتاب وثائق الفيديو الكبيرة (L ≥ 20) ترشيح الكتلة الحيوية الميكروبية ، وتتراوح ما بين 0.22μm 2.7μm في القطر ، من عمود الماء.

Abstract

يبدأ سير العمل في جمع المياه البحرية الساحلية للمجتمع الميكروبية المصب ، ويحلل الغاز المغذيات والتتبع. لهذا الأسلوب ، وقد تم جمع عينات من سطح التشغيل سفينتى جون ستريكلاند في مدخل Saanich. هذا الكتاب وثائق الفيديو الكبيرة (L ≥ 20) ترشيح الكتلة الحيوية الميكروبية ، وتتراوح ما بين 0.22μm 2.7μm في القطر ، من عمود الماء. يمكن تصفيتها عينتين 20L في وقت واحد باستخدام مضخة وحدة واحدة مزودة أربعة رؤساء بالتناوب. ويتم الترشيح في الميدان في رحلات طويلة ، أو فور مقابل رحلات يومية. فمن المهم لتسجيل كمية المياه التي تمر عبر كل وحدة تصفية sterivex. لمنع تشكيل بيوفيلم رحلات بين أخذ العينات ، يجب شطف جميع المعدات الترشيح مع حمض الهيدروكلوريك المخفف والمياه وتعقيمها منزوع الأيونات بعد الاستعمال مباشرة. وسوف يستغرق هذا الإجراء ما يقرب من 5 ساعات بالإضافة إلى ساعة إضافية للتنظيف.

Protocol

مجموعة تتكون من أجهزة الترشيح
1. لإعداد جهاز الترشيح ، واستخدام ملاقط لوضع الصف GF / D تصفية وحدة سكنية في prefilter. تشديد فضفاضة السكن باليد. وكقاعدة عامة ، لا الإفراط في تشديد أو الوحدة مرة واحدة في تسرب سوف يبدأ الضخ.
2. استبدال الغطاء الدامجانة زجاجة كبيرة مع غطاء تعقيمها والأنابيب التي توليها إدراج بعناية الأنبوب الداخلي في الدامجانة زجاجة كبيرة دون لمسها. إذا كان ذلك ضروريا ، واستخدام ملاقط لتوجيه الأنبوب في الدامجانة زجاجة كبيرة.
3. تمرير الأنابيب الخارجية من خلال مضخة تمعجية.
4. إرفاق وحدة سكنية prefilter إلى نهاية كل من أنابيب خارجية (أي 2 وحدة في الدامجانة زجاجة كبيرة). إحكام اتصال مع كماشة.
ترشيح مياه البحر
1. لتبدأ تصفية مياه البحر ، وتشغيل المضخة وضبط سرعة تدفق إلى 1. رايتس ووتش إلى ضمان أن المياه التي يتم ضخها في الاتجاه الصحيح.
2. سماح 500 مل من المياه لتتدفق بحرية من خلال وحدة وprefilter في دورق L 1.
3. إيقاف المضخة ، وإرفاق تصفية Sterivex لتركيب luer الذكور في نهاية خالية من الإعداد prefilter. تشديد بشكل مريح السكن prefilter باليد.
4. مراقبة في السكن prefilter وعلى العلاقة بين السكن وprefilter الأنبوب الذي يؤدي إلى الدامجانة زجاجة كبيرة. إذا تسرب يحدث ، تشغيل المضخة قبالة وتخفيف وإعادة إحكام السكن prefilter تبعا لذلك. تشغيل المضخة مرة أخرى.
5. جمع الراشح في قوارير ل 4. بمجرد أن يتم بالكامل ، والقوارير الفارغة في الدامجانة زجاجة كبيرة نظيفة. لا شك أن نلاحظ حجم مرت كل مرشح. ويمكن جمع مزيد من معالجة الرشاحة ، مثل الترشيح للبحث عن الفيروسات.
6. يستمر الترشيح حتى لا تبقى المياه في carboys. كالعادة مجموعة مرات الترشيح بين 4-5 ح / 20 L الدامجانة زجاجة كبيرة ، ولكن هذا يعتمد بشكل كبير على كمية الكتلة الحيوية داخل الماء.
7. الترشيح مرة واحدة كاملة ، تبديل المضخة وقطع المرشحات Sterivex.
تخزين الفلاتر
1. لتخزين المرشحات ، وطرد الأولى أي المياه المتبقية مع حقنة مل 30-60.
2. باستخدام ماصة ، إضافة 1.8ml العازلة تحلل إلى تصفية ، وحفظ ~ 200 UL الفضاء في تصفية بالإضافة إلى وقت لاحق من الكواشف.
3. ختم الجزء السفلي والعلوي من تصفية Sterivex مع قطعة صغيرة من Parafilm ، وتسمية المرشحات مع التاريخ وتحديد العينة.
4. تخزين المرشحات في مرحلة ما قبل المسمى 50 مل في أنبوب الصقر -80 درجة مئوية
5. إزالة عوامل التصفية من وحدة سكنية ووضعها المسمى أنابيب فالكون 50 مل تحتوي على 2 مل من تحلل العازلة. تخزين هذه في -80 درجة مئوية.
تنظيف
1. لتنظيف النهائي ، وضع الأنابيب التي كان داخل الدامجانة زجاجة كبيرة في قارورة تحتوي على حمض الهيدروكلوريك 0.1 M
2. توجيه أنابيب التي تؤدي إلى القارورة 4L في الدامجانة زجاجة كبيرة الأصلي.
3. التبديل على المضخة وتشغيلها في 3 ، وجمع من خلال تدفق تشغيل في الدامجانة زجاجة كبيرة الأصلي.
4. أخيرا ، شطف الأنابيب بالماء تعقيمها.

ممثل النتائج : النتيجة النهائية يتكون من المرشحات التي تحتوي كل منهما Sterivix الكتلة الحيوية الميكروبية من مياه البحر حوالي 10 لتر في نطاق وحجم 0.22μm 2.7μm. يتم تخزين هذه العازلة في تحلل وعلى استعداد لاستخراج الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الإجراء تجمع وتركز الكتلة أكبر من 2.7 ميكرون ، على prefilters GF / د. كما يتم تخزين هذه العازلة في تحلل وعلى استعداد لاستخراج الحمض النووي. إذا اتخذت خطوات معالجة إضافية ، ويمكن أن تتركز على 0.22 ميكرومتر التدفق من خلال وصولا الى جمع الكسر الفيروسية كذلك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ومن الضروري أن يمسح أسفل المقاعد ومضخات بمنشفة مبللة بعد الاستخدام لإزالة أي آثار متبقية من المياه المالحة التي من شأنها أن خلاف ذلك تآكل المعدات. على الرغم من أن هذا الإجراء هو بسيط ، يمكن أن تكون واسعة شرط الوقت اعتمادا على تركيز الكتلة الحيوية أو الحطام في العينة التي تمت تصفيتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نود أن نشكر المؤسسة الكندية للإبداع ، ومعارف كولومبيا البريطانية وصندوق التنمية الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث (NSERC) من كندا لدعم الدراسات الجارية على المناطق المنخفضة من الأوكسجين مياه المحيطات والمناطق الساحلية المفتوحة. كان مدعوما من قبل شعبة النهوض بالمرأة من الزمالات NSERC ، Killam ومؤسسة التمويل مركز تولا للتنوع وتطور الميكروبية.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps		Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors		Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing		ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)		Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps				For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters		EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters		Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer	Reagent			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl	Reagent			For post-filtration rinse
Autoclaved water	Reagent			For post-filtration rinse