Biology

Volume di grandi dimensioni (20L +) Filtrazione di campioni d'acqua di mare costiero

Published: June 18, 2009 doi: 10.3791/1161

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

Questo volume video di documenti di grandi dimensioni (≥ 20 L) filtrazione di biomassa microbica, compresa tra 0.22μm e 2.7μm di diametro, dalla colonna d'acqua.

Abstract

Il flusso di lavoro inizia con la raccolta delle acque marine costiere per la comunità microbica a valle, le analisi dei nutrienti e dei gas traccia. Per questo metodo, i campioni sono stati raccolti dal ponte della HMS operativo John Strickland a Inlet Saanich. Questo volume video di documenti di grandi dimensioni (≥ 20 L) filtrazione di biomassa microbica, compresa tra 0.22μm e 2.7μm di diametro, dalla colonna d'acqua. Due campioni 20L può essere filtrato contemporaneamente utilizzando una sola unità pompa dotata di quattro teste rotanti. La filtrazione è fatto nel settore lunghi viaggi, o immediatamente dopo il ritorno per gite di un giorno. E 'importante registrare la quantità di acqua che passa attraverso ogni unità sterivex filtro. Per prevenire la formazione di biofilm tra i viaggi di campionamento, tutte le apparecchiature di filtrazione devono essere lavate con acido cloridrico diluito e acqua deionizzata e sterilizzati in autoclave immediatamente dopo l'uso. Questa procedura richiederà circa 5 ore più un ora in più per la pulizia.

Protocol

Messa a punto di apparecchiature di filtrazione
1. Per impostare l'apparato di filtrazione, utilizzare una pinzetta per posizionare un grado GF / D filtro in unità abitativa prefiltro. Liberamente stringere la custodia a mano. Come regola generale, non stringere troppo o l'unità perdite una volta che la parte di pompaggio.
2. Sostituire il tappo di damigiana con il tappo in autoclave e il tubo attaccato con attenzione inserito il tubo interno in damigiana senza toccarla. Se necessario, utilizzare una pinzetta per guidare il tubo nel damigiana.
3. Far passare il tubo esterno attraverso la pompa peristaltica.
4. Collegare unità abitative prefiltro alla fine di entrambi i tubi esterni (2 unità per damigiana). Stringere la connessione con le pinze.
Filtrazione di acqua di mare
1. Per iniziare a filtrare l'acqua di mare, accendere la pompa e impostare la velocità di flusso a 1. Guarda per assicurare che l'acqua viene pompata nella direzione corretta.
2. Lasciare 500 ml di acqua di fluire liberamente attraverso l'unità prefiltro e in un contenitore 1 L.
3. Spegnere la pompa, e collegare un filtro Sterivex al raccordo maschio luer alla fine privo di configurazione prefiltro. Serrare le abitazioni prefiltro comodamente a mano.
4. Guarda per l'alloggiamento prefiltro e al collegamento tra il corpo prefiltro e il tubo che porta alla damigiana. Se si verificano perdite, spegnere la pompa fuori e allentare e stringere di nuovo la custodia prefiltro di conseguenza. Accendere la pompa di nuovo.
5. Raccogliere il filtrato in 4 fiaschi L. Una volta che sono piene, vuote i flaconi in una damigiana pulito. Assicurarsi di prendere nota del volume passa attraverso ciascun filtro. Raccolti filtrato possono essere ulteriormente elaborati, come ad esempio la filtrazione di virus.
6. Continuare a filtrare l'acqua fino a quando non viene lasciato in damigiane. Solita gamma di filtrazione volte tra 4-5 ore / 20 L damigiana, ma questo dipende drammaticamente dalla quantità di biomassa all'interno dell'acqua.
7. Una volta che la filtrazione è completa, accendere la pompa e staccare i filtri Sterivex.
Conservazione dei filtri
1. Per memorizzare i filtri, prima espellere l'acqua residua con una siringa da 30-60 ml.
2. Usando una pipetta, aggiungere buffer di lisi 1.8ml al filtro, mantenendo ~ 200 ul di spazio nel filtro per la successiva aggiunta di reagenti.
3. Sigillare la parte inferiore e superiore del filtro Sterivex con un piccolo pezzo di Parafilm, i filtri e l'etichetta con la data e l'identificazione del campione.
4. Conservare i filtri in un pre-etichettati tubo da 50 ml di falco a -80 ° C
5. Rimuovere i filtri dalla unità abitativa e metterli in etichetta tubi Falcon da 50 ml contenente 2 ml di tampone di lisi. Conservare questi a -80 ° C.
Pulizia
1. Per la pulizia finale, posto il tubo che era dentro la damigiana in un pallone contenente 0,1 M HCl
2. Diretto il tubo che porta al pallone 4L in damigiana originale.
3. Accendere la pompa e correre a 3, raccogliendo il flusso attraverso eseguito in damigiana originale.
4. Infine, sciacquare il tubo con l'acqua in autoclave.

Risultati rappresentante: Il risultato finale è costituito da due filtri Sterivix ognuno contenente biomassa microbica da circa 10 L di acqua di mare nella gamma di dimensioni di 0.22μm e 2.7μm. Questo è memorizzato in tampone di lisi e pronto per l'estrazione del DNA. Inoltre, questa procedura raccoglie e concentra biomassa superiore a 2,7 micron, il GF / D prefiltri. Questo è anche memorizzate nel buffer di lisi e pronto per l'estrazione del DNA. Se i passaggi ulteriori elaborazioni sono adottate, il 0,22 mM flow-through può essere concentrato verso il basso per raccogliere la frazione virale pure.

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Discussion

E 'indispensabile per pulire panche e pompe con un panno umido dopo l'uso per rimuovere ogni traccia persistente di acqua salata che altrimenti corrodere attrezzature. Anche se la procedura è semplice, il requisito di tempo può essere esteso a seconda della concentrazione di biomassa o detriti nel campione essere filtrato.

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Acknowledgments

Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. DAW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC, Killam e la fondazione TULA Centro finanziato per la diversità microbica e Evolution.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps		Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors		Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing		ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)		Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps				For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters		EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters		Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer	Reagent			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl	Reagent			For post-filtration rinse
Autoclaved water	Reagent			For post-filtration rinse