Summary
Este vídeo volume de documentos grandes (≥ L 20) de filtragem da biomassa microbiana, variando entre 0.22μm e 2.7μm de diâmetro, a partir da coluna de água.
Abstract
O fluxo de trabalho começa com a recolha de águas marinhas costeiras para a comunidade microbiana a jusante, as análises de nutrientes e gases traço. Para este método, as amostras foram coletadas a partir do convés do HMS operacional John Strickland em Inlet Saanich. Este vídeo volume de documentos grandes (≥ L 20) de filtragem da biomassa microbiana, variando entre 0.22μm e 2.7μm de diâmetro, a partir da coluna de água. Duas amostras de 20L podem ser filtrados simultaneamente usando uma unidade de bomba simples equipados com quatro cabeças rotativas. Filtração é feito no campo em viagens longas, ou imediatamente após o retorno para viagens curtas. É importante registrar a quantidade de água que passa através de cada unidade de filtro sterivex. Para evitar a formação de biofilme entre viagens de amostragem, todos os equipamentos de filtração deve ser lavado com HCl diluído e água deionizada e autoclavada imediatamente após o uso. Este procedimento levará aproximadamente cinco horas, mais uma hora adicional para a limpeza.
Protocol
- Instalação de aparelho de filtração
- Para configurar o aparelho de filtração, use uma pinça para colocar uma grade GF / D filtro na unidade de habitação pré-filtro. Vagamente apertar a habitação com a mão. Como regra geral, não aperte demais ou a unidade vai vazar uma vez que o começa a pulsar.
- Recoloque a tampa garrafão com a tampa autoclavada e tubos ligados com cuidado de inserir o tubo interno para o garrafão sem tocá-lo. Se necessário, use uma pinça para guiar o tubo no garrafão.
- Passe a tubulação externa através da bomba peristáltica.
- Anexar unidades habitacionais pré-filtro para o fim de ambos os tubos externos (ou seja, 2 unidades por garrafão). Aperte a conexão com um alicate.
- Filtração da água do mar
- Para começar a filtrar a água do mar, ligue a bomba e definir a velocidade de fluxo para 1. Relógio para garantir que a água está sendo bombeado na direção correta.
- Permitir que 500 ml de água para fluir livremente através da unidade de pré-filtro e em um copo de 1 litro.
- Desligar a bomba, e anexar um filtro Sterivex ao encaixe macho luer na extremidade livre de configuração pré-filtro. Aperte o confortavelmente de habitação pré-filtro com a mão.
- Preste atenção para a habitação pré-filtro e na ligação entre a caixa pré-filtro ea tubulação que leva ao garrafão. Se ocorrer vazamentos, desligar a bomba e soltar e apertar novamente o pré-filtro de habitação em conformidade. Ligar a bomba novamente.
- Recolher o filtrado em 4 frascos L. Uma vez cheios, os frascos vazios em um garrafão limpo. Certifique-se de anotar o volume passou por cada filtro. Coletados filtrado pode ser processado, como filtragem de vírus.
- Continue até que não haja filtragem da água é deixada no garrafões. Usuais de filtração gama vezes entre 4-5 h / 20 carboy L, no entanto, isso depende de forma dramática na quantidade de biomassa dentro da água.
- Uma vez que a filtração é completa, ligue a bomba e desconecte os filtros Sterivex.
- Armazenamento do filtro
- Para armazenar os filtros, primeiro expulsar qualquer água restante com uma seringa ml 30-60.
- Com uma pipeta, adicionar tampão de lise 1.8ml para o filtro, mantendo ~ ul 200 de espaço no filtro para adição posterior de reagentes.
- Seal parte inferior e superior do filtro Sterivex com um pequeno pedaço de parafilme, e rotular os filtros com a data ea identificação da amostra.
- Armazenar os filtros em 50 ml de pré-rotulados tubo falcon a -80 ° C
- Remover os filtros da unidade habitacional e colocá-los em tubos de 50 ml rotulados Falcon contendo 2 ml de tampão de lise. Armazenar estes a -80 ° C.
- Limpeza
- Para limpeza final, coloque o tubo que estava dentro do garrafão em um frasco contendo 0,1 M HCl
- Direcionar o tubo que levam ao balão 4L no garrafão original.
- Ligue a bomba e executar a 3, coletando o fluxo através executado no garrafão original.
- Finalmente, lavar o tubo com água esterilizada.
Resultados Representante: O resultado final consiste em dois filtros Sterivix cada um contendo biomassa microbiana de aproximadamente 10 L de água do mar na faixa de tamanho de 0.22μm e 2.7μm. Este é armazenado em tampão de lise e pronto para a extração de DNA. Além disso, este procedimento recolhe e concentra biomassa maior do que 2,7 mM, sobre o pré-filtros GF / D. Este também é armazenado em tampão de lise e pronto para a extração de DNA. Se as etapas de processamento adicional são tomadas, a 0,22 mM de fluxo pode ser concentrada até recolher a fração viral também.
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Discussion
É imperativo para limpar os bancos e as bombas com uma toalha úmida após o uso para remover qualquer vestígio remanescente de água salgada que de outra forma corroer equipamentos. Embora o procedimento é simples, o requisito de tempo pode ser extensa, dependendo da concentração de biomassa ou resíduos na amostra que está sendo filtrado.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. DAW foi apoiado por bolsas de NSERC, Killam ea fundação TULA Centro financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Peristaltic pump | Masterflex (Cole Palmer) | 77913-20, 77200-62, 77200-04 | ||
Tygon LFL tubing | Masterflex (Cole Palmer) | 06429-24 | For filtration apparatus | |
Hose clamps | Cole-Parmer | 0683204 | For filtration apparatus | |
1/4” x 3/16” pipe adaptors | Cole-Parmer | 31702-20 | For filtration apparatus | |
Polypropylene prefilter housing | ADVANTEC | 501200 | For filtration apparatus | |
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock) | Cole-Parmer | 31507-27 | For filtration apparatus | |
2“ Magnets | For filtration apparatus | |||
3 port carboy caps | For filtration apparatus | |||
GV 0.22 μm STERIVIX filters | EMD Millipore | SVGV01R5 | ||
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters | Whatman, GE Healthcare | 1823047 | ||
Lysis buffer | Reagent | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
0.1 % HCl | Reagent | For post-filtration rinse | ||
Autoclaved water | Reagent | For post-filtration rinse |