Большой объем (20 л +) Фильтрация прибрежной морской воды Образцы

Summary

Это видео документов большого объема (≥ 20 л) фильтрация микробной биомассы, в диапазоне между 0.22μm и 2.7μm в диаметре, из толщи воды.

Abstract

Рабочий процесс начинается со сбора прибрежные морские воды ниже по течению микробного сообщества, питательных веществ и следов анализ газа. Для этого метода образцы были собраны с палубы HMS Джон Стрикленд, работающих в Саанич входе. Это видео документов большого объема (≥ 20 л) фильтрация микробной биомассы, в диапазоне между 0.22μm и 2.7μm в диаметре, из толщи воды. Два 20L образцы могут быть отфильтрованы одновременно, используя один насосный агрегат оснащен четырьмя вращающимися головками. Фильтрация осуществляется в поле на расширенной поездки, или сразу после возвращения для однодневных поездок. Важно, чтобы записать количество воды, проходящей через каждую единицу sterivex фильтр. Чтобы предотвратить образование биопленки между выборки поездки, все оборудование для фильтрации следует промыть разбавленным HCl и деионизированной воды и автоклавного сразу после использования. Эта процедура займет около 5 часов плюс дополнительный час для очистки.

Protocol

1. Настройка фильтрации аппарата
   1. Для настройки фильтрации аппарат, используйте пинцет, чтобы место класса GF / D фильтр в блок предварительной очистки жилья. Свободно затянуть жилья вручную. Как правило, не затягивайте или подразделение будет течь один раз насосных начинается.
   2. Замените бутыль шапка с автоклавного крышкой и придает трубки тщательно вставки внутренних трубку в бутыль, не касаясь его. Если необходимо, используйте пинцет, чтобы руководство трубку в бутыль.
   3. Пропустите через внешние трубки перистальтического насоса.
   4. Прикрепить единиц предфильтр жилья до конца как внешних, так трубок (т.е. 2 единиц в бутыль). Затяните связи с плоскогубцами.
2. Фильтрация морской воды
   1. Для начала фильтрации морской воды, включить насос и набор скорости потока 1. Смотреть, чтобы вода закачивается в правильном направлении.
   2. Разрешить 500 мл воды свободно проходить через фильтр предварительной очистки блока и в 1 л стакан.
   3. Выключите насос и прикрепите фильтр Sterivex к мужскому Луер установки на свободном конце установки предварительной очистки. Затяните уютно предфильтр жилья вручную.
   4. Смотреть по крайней жилья предфильтр и на связь между жильем и предварительной очистки трубы, что приводит к бутыли. Если утечка происходит, включите насос выходные и ослабить и затянуть предфильтр жилья соответственно. Включите насос обратно.
   5. Сбор фильтрата в 4 колбы L. Как только они полны, пустые колбы в чистую бутыль. Обязательно укажите объем проходит через каждого фильтра. Сборник фильтрата может быть дополнительно обработан, таких как фильтрация на наличие вирусов.
   6. Продолжить фильтрации пока вода не остается в бутыли. Обычная фильтрация раз в диапазоне от 4-5 ч / 20 л бутыли, однако, это зависит сильно от количества биомассы в воде.
   7. После фильтрации завершения переключения насоса и отсоедините Sterivex фильтров.
3. Хранение фильтры
   1. Чтобы сохранить фильтры, сначала изгнать всю оставшуюся воду с 30-60 мл шприца.
   2. Используя пипетку, добавьте 1.8ml буфера для лизиса на фильтр, сохраняя ~ 200 мкл пространства в фильтр для последующего добавления реагентов.
   3. Уплотнение нижней и верхней части Sterivex фильтр с небольшой кусочек парафильмом, и этикетки фильтры с датой и образцов идентификации.
   4. Магазин фильтров в предварительно меченных 50 мл трубки сокола при -80 ° C
   5. Удаление фильтров из корпуса устройства и разместить их в подписанные 50 мл пробирки Сокол, содержащий 2 мл лизирующего буфера. Храните эти при температуре -80 ° C.
4. Уборка
   1. Для окончательной очистки, место трубки, что было внутри бутыли в колбу, содержащую 0,1 М HCl
   2. Прямая трубка, которые приводят к 4L колбу в оригинальной бутыль.
   3. Включите насос и работают на 3, собирая поток через работать в оригинальной бутыль.
   4. Наконец, промойте трубки с автоклавного воды.

Представитель Результаты: Окончательный результат состоит из двух фильтров Sterivix каждый из которых содержит микробной биомассы с примерно 10 литров морской воды в диапазоне размеров от 0.22μm и 2.7μm. Он сохраняется в буфере для лизиса и готовы к экстракции ДНК. Кроме того, эта процедура собирает и концентрирует биомассы больше 2,7 мкм, на GF / D предварительные фильтры. Это также хранятся в буфере для лизиса и готовы к экстракции ДНК. Если дополнительные шаги обработки будут приняты, 0,22 мкм проточные может быть сосредоточено до сбора вирусных фракция, а также.

Discussion

Крайне важно, чтобы протереть скамейки и насосы с мокрым полотенцем после использования, чтобы удалить любые вялые следы соленой воды, которые могли бы коррозии оборудования. Хотя процедура проста, время требование может быть обширным в зависимости от концентрации биомассы или мусора в образце фильтруется.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps		Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors		Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing		ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)		Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps				For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters		EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters		Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer	Reagent			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl	Reagent			For post-filtration rinse
Autoclaved water	Reagent			For post-filtration rinse