Summary
Questo volume video di documenti di piccole dimensioni (~ 1 L) filtrazione di biomassa microbica dalla colonna d'acqua.
Abstract
Il flusso di lavoro inizia con la raccolta delle acque marine costiere per la comunità microbica a valle, le analisi dei nutrienti e dei gas traccia. Per i campioni manifestazione di oggi s sono stati raccolti dal ponte della HMS operativo John Strickland a Inlet Saanich. Questo volume video di documenti di piccole dimensioni (~ 1 L) filtrazione di biomassa microbica dalla colonna d'acqua. Il protocollo è un'estensione del protocollo di campionamento grandi volumi descritto in precedenza, con una fondamentale differenza: qui non c'è pre-filtrazione passo, per cui tutte le classi dimensionali delle biomasse sono raccolti fino al 0,22 micron di taglio del filtro. I campioni raccolti in questo modo sono l'ideale per l'analisi degli acidi nucleici. Il set-up, la filtrazione e la pulizia passi ogni impiegano circa 20-30 minuti. Se si utilizzano due pompe peristaltiche contemporaneamente, fino a 8 campioni possono essere filtrati allo stesso tempo. Per prevenire la formazione di biofilm tra i viaggi di campionamento, tutte le apparecchiature di filtrazione devono essere lavate con acido cloridrico diluito e acqua deionizzata e sterilizzati in autoclave immediatamente dopo l'uso.
Protocol
- Messa a punto di apparecchiature di filtrazione
- Prima di filtrare, in primo luogo asciugherà eventuale condensa dal bottiglie piene e pesarli
- Inserire un bin autoclave su un lato della pompa, e il pallone dei rifiuti dall'altro.
- Poi posto una bottiglia piena campione nel cestino autoclave, tuttavia, non rimuovere il tappo della bottiglia ancora.
- Passare attraverso il tubo della pompa peristaltica modo che l'estremità luer del tubo è nel pallone.
- Utilizzando una pinzetta, togliere il cotone da una pipetta sterile 25 ml, e allegare la pipetta per l'altra estremità del tubo.
- Filtrazione di acqua di mare
- Per iniziare il filtraggio dell'acqua di mare, aprire la bottiglia e inserire la pipetta. Accendere la pompa e impostare la velocità di flusso a 1. Guarda per assicurare che l'acqua viene pompata nella direzione corretta.
- Lasciare ~ 100 ml di acqua di passare attraverso il tubo intero.
- Spegnere la pompa e porre un filtro Sterivex al raccordo maschio luer alla estremità libera del tubo.
- Continuare a filtrare l'acqua fino a quando non viene lasciato in bottiglia.
- Conservazione dei filtri
- Per memorizzare i filtri, prima espellere l'acqua residua con una siringa da 30-60 ml.
- Sigillare il fondo del filtro Sterivex con Parafilm. Usando una pipetta, aggiungere buffer di lisi 1.8ml al filtro, mantenendo ~ 200 ul di spazio nel filtro per la successiva aggiunta di reagenti.
- Poi, sigillare la parte superiore del filtro Sterivex con un piccolo pezzo di Parafilm, i filtri e l'etichetta con la data e l'identificazione del campione.
- Conservare i filtri pre-etichettati 50 ml tubi falco a -80 ° C
- Ripulire
- Inserire la pipetta 25 ml in un pallone contenente 0,1% di HCl, e accendere la pompa.
- Dopo il lavaggio HCl, sciacquare il tubo con l'acqua in autoclave.
Infine, misurare e registrare la massa delle bottiglie ormai vuote 1L al fine di calcolare il volume di acqua passata attraverso il filtro.
Risultati Rappresentante: Unità 1 campione di acqua L produce uno Sterivix filtro, che contiene biomassa superiore a 0,22 micron. Questo è memorizzato in tampone di lisi per l'estrazione del DNA e analisi successive. Il risultato finale è costituito da un filtro Sterivix per ogni bottiglia da 1 litro memorizzate nel buffer di lisi e pronto per l'estrazione del DNA. Il filtro contiene biomassa superiore a 0,22 micron. I filtri possono essere conservati a -80 ° C prima dell'estrazione Edna.
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Discussion
E 'indispensabile per pulire panche e pompe con un panno umido dopo l'uso per rimuovere ogni traccia persistente di acqua salata che altrimenti corrodere attrezzature. Anche se la procedura è semplice, il requisito di tempo può essere esteso a seconda della concentrazione di biomassa o detriti nel campione essere filtrato.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. DAW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC, Killam e la fondazione TULA Centro finanziato per la diversità microbica e Evolution.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Peristaltic pump | Masterflex (Cole Palmer) | 77913-20, 77200-62, 77200-04 | |
Tygon LFL tubing | Masterflex (Cole Palmer) | 06429-24 | For filtration apparatus |
Hose clamps | Cole-Parmer | 0683204 | For filtration apparatus |
1/4” x 3/16” pipe adaptors | Cole-Parmer | 31702-20 | For filtration apparatus |
Polypropylene prefilter housing | ADVANTEC | 501200 | For filtration apparatus |
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock) | Cole-Parmer | 31507-27 | For filtration apparatus |
2“ Magnets | For filtration apparatus | ||
3 port carboy caps | For filtration apparatus | ||
GV 0.22 μm STERIVIX filters | EMD Millipore | SVGV01R5 | |
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters | Whatman, GE Healthcare | 1823047 | |
Lysis buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
0.1 % HCl | For post-filtration rinse | ||
Autoclaved water | For post-filtration rinse |