沿岸海水試料の少量（1 - 3L）のろ過

Summary

このビデオドキュメント少量（〜1L）水柱から微生物バイオマスのろ過。

Abstract

ワークフローは、下流の微生物群集のための沿岸海域、栄養素と微量ガス分析の収集から始まります。今日のデモのサンプルについてはサーニッチのインレットでHMSジョンストリックランドの動作のデッキから採取された。このビデオドキュメント少量（〜1L）水柱から微生物バイオマスのろ過。プロトコルは、大量のサンプリングプロトコルつの大きな違いは、前述のの拡張です：ここで、は事前に濾過工程が存在しない、バイオマスのようにすべてのサイズクラスはカットオフフィルター0.22μmの下に収集されます。サンプルは、核酸分析のための理想的なこの方法を集めた。セットアップ、ろ過し、クリーンアップ手順は、それぞれ20〜30分程度かかります。最大8サンプルを同時にフィルタリングすることが、同時に二つの蠕動ポンプを使用している場合。サンプリングの合間にバイオフィルム形成を防止するために、すべてのろ過装置を希HCl及び脱イオン水で洗浄し、使用後すぐにオートクレーブする必要があります。

Protocol

1. ろ過装置のセットアップ。
   1. フィルタリングの前に、最初のフルボトルから任意の結露を拭うと、それらの重量を量る
   2. 他の上でポンプの一方の側にオートクレーブビン、および廃棄物のフラスコを置きます。
   3. その後、オートクレーブビンで完全なサンプルのボトルを置いているが、まだボトルのキャップを外さないでください。
   4. チューブのルアー最後はフラスコになるように蠕動ポンプでチューブを渡します。
   5. ピンセットを使用して、滅菌25mlのピペットから綿を除去し、チューブのもう一方の端にピペットを取り付ける。
2. 海水のろ過
   1. 海水のフィルタリングを開始するために、ボトルを開いて、ピペットを挿入する。ポンプの電源を入れ、1にフローの速度を設定します。その水が適切な方向に励起されるように監視します。
   2. 水の〜100 mlの全体のチューブを通過することができます。
   3. ポンプの電源をオフにし、チューブの自由端にオスルアーフィッティングにSterivexフィルタを取り付けます。
   4. ない水がボトルに残っていないまでフィルタリングを続けます。
3. フィルターの保管
   1. フィルタを保存するには、まず、30〜60ミリリットルの注射器と、残りの水を排出する。
   2. パラフィルムでSterivexフィルターの底部をシール。ピペットを用いて、試薬の後に追加するためのフィルタでスペースの〜200μlの維持、フィルターに1.8ミリリットルの溶解バッファーを追加します。
   3. その後、パラフィルムの小片でSterivexフィルターの上部をシールし、日付とサンプルの識別とフィルタラベルを付けます。
   4. -80あらかじめ標識した50mlファルコンチューブにフィルターを保管° C
4. クリーンアップ
   1. 塩酸0.1％含有するフラスコに25mlのピペットを挿入し、ポンプのスイッチをオンにします。
   2. 塩酸洗浄した後、オートクレーブ水でチューブをリンス。
      
      最後に、測定し、フィルタを通過した水の体積を計算するために、今の空の1Lボトルの質量を記録する。

代表的な結果：各1 Lの水サンプルは、0.22μmのよりも大きいバイオマスを含むものSterivixフィルタを、もたらす。これは、その後のDNA抽出および分析のために溶解バッファーに格納されています。最終結果は、溶解バッファーおよびDNA抽出のための準備に格納されている1リットルの瓶ごとにSterivixフィルタで構成されています。フィルタは、0.22μmを超えるバイオマスが含まれています。フィルタは、° Cの前エドナの抽出に-80℃で保存することができます。

Discussion

それ以外の機器を腐食させるという塩水のいずれか残る痕跡を除去するために使用後の湿ったタオルでベンチやポンプを拭うために不可欠です。手順はシンプルですが、時間の要件は、フィルタリングされているサンプルのバイオマスや破片の濃度に応じて豊富なことができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps	Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors	Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing	ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps			For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters	EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters	Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			For post-filtration rinse
Autoclaved water			For post-filtration rinse