Ontleden en opnemen van The C. Elegans neuromusculaire junctie

Summary

Toepassing van elektrofysiologie toegankelijke synapsen biedt een kwantificeerbare maat van synaptische activiteit, nuttig bij het analyseren van synaptische mutanten. Dit artikel beschrijft een dissectie methode die wordt gebruikt om de neuromusculaire verbindingen (NMJ) van bloot

Abstract

Neurotransmissie is het proces waarbij neuronen informatie via chemische signalen over te dragen aan hun post-synaptische doelstellingen, op een snelle tijdschaal. Dit complexe proces vereist de gecoördineerde activiteit van de vele pre-en post-synaptische proteïnen te zorgen voor een passende synaptische connectiviteit, geleiding van elektrische signalen, targeting en priming van secretorische vesikels, calcium, blaasje fusion, lokalisatie en functie van postsynaptische receptoren en ten slotte, recycling mechanismen. Omdat neurowetenschappers Het is ons doel om toe te lichten welke eiwitten functioneren in elk van deze stappen en begrijpen van hun werkingsmechanismen. Elektrofysiologische opnames van synapsen zorgen voor een kwantificeerbare lezen van de onderliggende elektrische gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de synaptische transmissie. Door het combineren van deze techniek met de krachtige reeks van moleculaire en genetische tools beschikbaar om synaptische eiwitten in C. te manipuleren elegans, kunnen analyseren we de resulterende functionele veranderingen in de synaptische transmissie.

De C. elegans NMJs gevormd tussen motorneuronen en lichaamswand spieren controle motoriek, dus mutanten met ongecoördineerde motorische fenotypes (bekend als unc s) vaak verstoren synaptische transmissie op deze synapsen ^1. Omdat unc mutanten worden onderhouden op een rijk aanbod van een bacteriële voedselbron, blijven ze levensvatbaar zolang ze een aantal pharynx pompen vermogen om voedsel innemen behouden. Dit, samen met het feit dat de C. elegans bestaan ​​als hermafrodieten, hen in staat stelt om op mutant nakomelingen doorgeven, zonder de noodzaak voor uitgebreide dekking gedrag. Deze eigenschappen, in combinatie met onze recente mogelijkheid om op te nemen van de wormen NMJs ^2,3,7 maken dit een uitstekend model organisme waarin u precies hoe unc mutanten invloed neurotransmissie pakken.

De dissectie methode houdt immobiliseren volwassen wormen met behulp van een cyanoacrylic lijm om een ​​incisie te maken in de worm cuticula het blootstellen van de NMJs. Sinds C. elegans volwassenen slechts 1 mm in de lengte van de dissectie wordt uitgevoerd met het gebruik van een dissectiemicroscoop en vereist een uitstekende hand-oog coördinatie. NMJ opnames zijn gemaakt door whole-cell spanning klemmen individuele lichaam muur spiercellen en neurotransmitter release kan worden opgewekt met behulp van een verscheidenheid aan stimulatie protocollen met inbegrip van elektrische stimulatie, door licht geactiveerde kanaal-rhodopsine-gemedieerde depolarisatie ⁴ en hyperosmotische zoutoplossing, die allemaal zullen worden kort beschreven.

Protocol

A. Bereiding van de instrumenten die worden gebruikt voor de dissectie.

1. De dissectie / opname kamer: Wij typisch onze opnamestudio kamer te bouwen uit een 1 / 16 ^e inch magnetische plaat, met een rond gat in het centrum, dat groot genoeg is om een 22 mm diameter ronde dekglas tegemoet te komen. De buitenste afmetingen van de kamer zal afhangen van de microscoop podium gebruikt om de opnamen te doen. Op de keerzijde van de magnetische plaat, hechten wij een 48 x 60 mm dekglas, die we op de kamer houden door het plaatsen van een pellet van lage melt Paraplax weefsel inbedding wax in elke hoek van het dekglas ingeklemd tussen het glas en de kamer . De was is dan gesmolten op een hete plaat, glazen plaat naar boven, tot het een continue laag het lijmen van de dekglas naar de kamer. Laat geen deze stap onbeheerd achter als de was smelt snel. De kamer moet worden verwijderd en zodra de was is gesmolten afgekoeld. Overtollige wax die sijpelde langs de binnenrand van de 22mm ronde holte kan worden verwijderd met behulp van een scheermesje rand.
2. Sylgard-gecoate dekglaasjes: De dissectie wordt uitgevoerd op een 22 mm, Sylgard gecoate dekglas dat is geplaatst in de ronde holte van de opname kamer. De Sylgard vacht helpt de cyanoacrylic lijm zich houden aan de dekglas bij het lijmen van de wormen naar beneden en fungeert ook als een kussen, waarop te breken terug de lijm pipetpunt wanneer het aangesloten. Sylgard bestaat uit verse volgens de instructies van de fabrikant (10 delen silicone basis op 1 deel verharder in gewicht). Een kleine druppel Sylgard wordt dan geplaatst op elke dekglas en uitgesmeerd over het gebruik van een scheermesje rand om een ​​effen oppervlak te maken. De gecoate dekglaasjes worden geplaatst in grote platte afgedekte containers en achtergelaten in een 65 ° graden oven 's nachts te genezen.
3. Pipetten: Typisch, gebruiken we dezelfde 1 mm buitendiameter gloeidraad borosilicaatglas aan de pipetten voor het lijmen van wormen af ​​te genereren, waardoor cuticula incisies en het opnemen van de spieren, met behulp van een elektrode puller. Het is raadzaam om een ​​pot van pipetten te trekken voordat u probeert een dissectie omdat dit stadium kan eisen dat een aantal snelle uitwisseling van pipetten.
4. Lijmapparaat: Lijm is geladen en toegepast vanaf de punt van een lijm pipet, met de mond-druk. Het verlijmen pipet wordt in het ene uiteinde van een 2 meter stuk polyethyleen buis met een inwendige diameter die de buitendiameter van de pipet glas (meestal 1 mm) wedstrijden. Het andere uiteinde van de slang bezit een Eppendorf pipet tip die fungeert als een mondstuk.
5. Extractie pipet: De worm ingewanden moeten worden verwijderd uit de worm holte zodra de cuticula incisie is gemaakt. Dit wordt bereikt met een stuk slang aangesloten op een eppendorf pipettip vergelijkbaar met de lijmapparaat maar in dit geval het glas extractie pipetpunt is weer genoeg gebroken om eieren en ingewanden gemakkelijk worden opgezogen uit de worm holte.

B. De dissectie

1. In de opname kamer een cirkelvormige wax pen lijn ligt in de buurt gevestigd op de omtrek van de kamer waar een Sylgard gecoate dekglas stevig wordt ingedrukt in plaats (Sylgard-coat naar boven). Deze wax lijn immobiliseert het dekglas en voorkomt de opname oplossing van sijpelen onder en loskomen van de dekglas tijdens de dissectie en opnemen. De kamer wordt vervolgens gevuld met extracellulaire oplossing en een aantal wormen worden geplaatst in het midden met behulp van een worm te kiezen. Worms zal zwemmen in een oplossing, maar met de praktijk kunnen deze wormen worden verlijmd zonder verdere procedures zoals koeling om beweging te voorkomen. Tijdens de training stadium kan het helpen om te lijmen mutant wormen waar zwemmen is aangetast (zoals unc-31 mutanten) praktijk.
2. Een lijm container, gemaakt van een PCR pet gehouden in was of klei, wordt gebruikt om een ​​werkvoorraad van de cyanoacrylic lijm vast te houden. Lijm pipetten met vergelijkbare afmetingen tip om de opname te pipetten (normaal ~ 4 megohm weerstand) worden gebruikt om lijm toe te passen. Met behulp van de lijm applicator, is een kleine hoeveelheid lijm opgezogen in de lijm pipet met behulp van de dissectie ruimte om de pipetpunt visualiseren als de lijm wordt opgezogen.
3. De cyanoacrylic lijm (HistoacrylBlue, Aesulap) polymeriseert bij contact met de extracellulaire oplossing, daarom is het belangrijk om positieve druk op de lijm pipet te behouden zoals het komt in de kamer oplossing om de lijm van de verharding te voorkomen en het aansluiten van de pipet. Zodra de lijm pipet is in de kamer oplossing, een kleine maar constante stroom van lijm moet worden aangebracht op het oppervlak onder Sylgard mond-druk controle om te voorkomen dat het aansluiten. Als de pipet verstopt raakt het kan soms worden gedeblokkeerd door voorzichtig tikken op de tip over de Sylgard-gecoat glas. Het is aanbevolen dat u lijmen oefenen voordat u probeert te lijmen wormen. Als u uw naam routinematig schrijven in lijm op de Sylgard, met letters gemaakt van lijnen dunner dan de wormen breedte bent u klaar om procIed aan het lijmen van de worm cuticula.
4. Te lijmen een worm, gebruik positieve-druk om een ​​kleine hoeveelheid lijm hechten aan zowel de kop of de staart van de worm en snel te trekken van de worm naar beneden op de Sylgard oppervlak. Probeer de worm bevestigen in het midden van de kamer als wormen te dicht bij de rand zal moeilijk worden om te bereiken met het opnemen van pipetten gelijmd. Breng dan een constante stroom van lijm langs de dorsale rand van cuticula de worm van de start beslag, waardoor de worm in een C-positie met de vulva naar binnen (voor de buik spier-opnamen). Eventuele lacunes in deze lijm lijn moet worden ingevuld, zodat de worm sterk is bevestigd, om de worm te voorkomen dat los tijdens de nagelriem incisie stap.
5. Om de nagelriem incisie, overschakelen naar een hand-held dissectie pipet. Dit pipet moet scherper dan de lijm / opname pipetten en een korte, stevige schacht hebben. Met behulp van de hoogste vergroting van de omvang ontleden, lijnt u de pipet evenwijdig aan de lengte-as van de worm en breng de tip over middelpunt langs de worm (de buurt van de vulva), het maken van de incisie aan de nagelriem / lijm interface. Deze incisie releases van de wormen hydrostatische druk dwingt eieren en ingewanden uit door de incisie punt. Ga door het snijden van de nagelriem richting van het hoofd van de worm met een beweging, zoals snijden om een ​​brief te openen, totdat u bij de keelholte. Overschakelen naar de winning pipet te zuigen uit de interne organen van de worm. Na het wissen van de incisie, zal de geopende cuticula te behouden is het cilindrische vorm. Gebruik een nieuw lijmen pipet om ter plaatse van de afgesneden rand van de cuticula las omlaag op de Sylgard oppervlak. Het is belangrijk om minimaal lijm vlekken te gebruiken om in dit stadium niet te beschadigen of verduisteren van de NMJs.
   De ventrale zenuw koord en lichaamswand spieren zijn nu bloot.
6. Naar de kelder membraan dat de NMJs afdekkingen, zuigen uit de extracellulaire oplossing uit de kamer en breng collagenase (0.4mg/ml in extracellulaire oplossing) voor ongeveer 10-20 seconden, verwijder en was verschillende keren met verse extracellulaire oplossing. Ga verder met de opname podium.

C. Patch-clamp-opname

1. Plaats de opname kamer op een up-right microscoop stadium met behulp van een 10x doelstelling om het centrum van de worm. Schakel over naar een 40x water-het verschijnen doelstelling met DIC en controleer of het lichaam muur spieren en zenuwen koord intact zijn. Plaats de worm, zodat de lengteas van de worm is parallel met de voorkant van het toepassingsgebied, waardoor de elektroden in te voeren van zowel de linker-en rechterkant.
2. Patch de spier met behulp van standaard patch-klemmen technieken. Registrerende elektroden van ongeveer 4 megohm weerstand goed werken. Zodra de elektrode raakt de spier membraan, verhoging van negatieve druk totdat een gigohm afdichting wordt verkregen. Voor het hele-cel-voltage-clamp opnamemodus, toe te passen zuig-en zap het membraan totdat de verzegeling is verbroken gigohm. In een goede opname, het lichaam muur spieren van wild-type volwassen wormen hebben meestal een cel-membraan capaciteit van ~ 70 pF en stabiel kan worden opgenomen voor minstens 10 minuten op een bedrijf potentieel van -60 mV met minimale holding stromingen (~ 50 pA).
3. De extracellulaire oplossing bestaat uit (in mm): NaCl 150, KCl 5, CaCl ₂ 5, MgCl ₂ 4, glucose 10, sucrose 5, HEPES 15 (pH 7,3, ~ 330mOsm). De patch pipet bevat (in mm): KCl 120, KOH 20, MgCl ₂ 4, (N-tris [Hydroxymethyl] mthyl-2-amino-sulfonzuur) TES 5, Dihydraat _CaCl2 0,25, Na _twee ATP 4, sucrose 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Let op: Deze oplossingen kunstmatig spiercellen belasting met chloor, zodat de GABA-receptor-gemedieerde stromen naar binnen zijn te wijten aan chloride efflux op een bedrijf potentieel van -60 mV. Variaties op deze oplossingen zijn gebruikt (zie publicaties voor details).
4. Opgeroepen release. Normaal gesproken plaatsen we een tweede elektrode met extracellulaire oplossing op het ventrale zenuw snoer juist voor de gepatchte spier. Deze losse patch configuratie vereist grote depolariserende stimuli (in de orde van 10s volts) van korte duur (1-2ms) om de maximale geëvoceerde responsen (typisch 2.0-2.5 nA) te bereiken, in wild-type wormen. De beperkingen van deze aanpak zijn: 1) Alleen een paar reacties opgeroepen kan worden geleverd voordat de zenuw snoer is onomkeerbaar beschadigd en 2) Om onbekende redenen, kan alleen cholinerge geëvoceerde responsen worden opgewekt met behulp van deze stimulatie configuratie.
5. Licht geactiveerde kanaal rhodopsine stimulatie. Onlangs heeft de Gottschalk lab opgewekt transgene wormen uiten van algen-afgeleide kanaal rhodopsins dat het membraan bij de licht-stimulatie depolariseren in subsets van neuronen, afhankelijk van de promotor wordt gebruikt om de expressie ⁴ rijden. In het geval van de C. elegans NMJ, geïntegreerde lijnen uitdrukken kanaal rhodopsine in ofwel de cholinerge neuronen of GABA-erge motorische neuronen zijn nu available. Omdat kanaal rhodopsine reageert alleen aan het licht toen all-trans retinal wordt geassocieerd met de opsin deel, moet wormen voor deze toepassing worden geteeld op bacteriën doorspekt met het netvlies. Een groen licht puls kan vervolgens worden gebruikt om herhaaldelijk te activeren het kanaal rhodopsine veroorzaakt evoked versie van een van beide ACh of GABA, afhankelijk van de transgene wormen worden gebruikt. Deze transgene wormen kunnen worden gekruist in de mutante stammen. Het voordeel van deze techniek de afgelopen elektrische stimulatie op te nemen; 1) Licht-activering veroorzaakt geen neuronale schade, waardoor vele herhalen stimulatie moet worden uitgevoerd en 2) Evoked bevrijding van zowel GABA-erge of cholinerge neuronen kunnen onafhankelijk van elkaar bestudeerd worden.
6. Hyperosmotische-geïnduceerde release. Om de grootte van de snel-vrij te vesicle zwembad (als gevolg van de samengevat pool van geprimed blaasjes uit alle NMJ's op de opgenomen spier), een druk-pipet met hyperosmotische extracellulaire oplossing (aangepast aan ~ 850 mOsm door het toevoegen van extra sucrose) wordt gebruikt te meten. Druk-puls toepassingen van 1-3 seconden produceren een spervuur ​​van asynchrone post-synaptische gebeurtenissen met behulp van de standaard oplossingen zoals hierboven beschreven.

Figuur 1: Schematisch overzicht van de C. elegans dissectie en neuromusculaire opname configuratie

Een Sylgard gecoate dekglaasje gemaakt door smeren een daling van Sylgard over het glas en uitharden 's nachts wordt geplaatst in de circulaire holte van de geprefabriceerde opname kamer en bedekt met recording oplossing. Een worm in het centrum is vastgelijmd aan de Sylgard oppervlak vanaf de kop of staart, het aanbrengen van lijm op de dorsale zijde van de worm, met behulp van een lijm pipet,. Zodra lijmen is voltooid, een incisie grenzend aan de vulva, op het grensvlak tussen de cuticula en de lijm is gemaakt met een glazen naald en uitgebreid in de richting van het hoofd (zie rode geperforeerde lijn). Na extractie van de ingewanden en eieren van de lichaamsholte, de gesneden rand van de incisie is gepuntlast met lijm aan de Sylgard het blootstellen van de ventrale zenuw (groen) en lichaam wand spieren (rood). De ventrale-mediale spier juist voor de vulva is patch-geklemd en de stimulerende elektrode wordt stroomopwaarts geplaatst op de zenuw snoer.

Representatieve resultaten

Whole-cell, spanning-geklemde lichaamswand spier-opnames worden getoond voor elk van de drie stimulatie protocollen hierboven beschreven (elektrisch opgewekt, licht opgewekte en hyperosmotische reacties). In alle gevallen is de ventrale-mediale lichaamswand spier is geklemd bij -60 mV. A. Wild-type spiercellen doorgaans vertonen een hoge mate van endogene innerlijke miniatuur synaptische stromen in onze standaard opname-oplossingen. B. Een 2ms depolarisatie van de voorste ventrale zenuw koord veroorzaakt synchrone vrijlating uit de verschillende synapsen wat resulteert in een grote opgewekte reacties van circa 2 tot 2,5 nA in wild-type wormen. Vertegenwoordiger van sporen aan de rechterkant van de wild-type sporen in A en B tonen synaptische release in een ernstig ongecoördineerde mutant (unc-18). Paneel C toont een lichte opgewekte antwoord van de neuromusculaire junctie van een wild-type worm te drukken kanaal rhodopsine in cholinerge neuronen. Een 2ms lichtpuls geeft gewoonlijk een respons van 1,5-1,8 nA. D. Druk-uitwerpen van 850 mOsm hyperosmotische zoutoplossing op de spier voor 1s, produceert een asynchrone spervuur ​​van miniatuur synaptische stromen die het gemakkelijk-vrij te pool van blaasjes.

Discussion

De genetische model organisme C. elegans is bij uitstek geschikt voor de studie van synaptische transmissie, door de functionele analyse van mutaties in genen die coderen voor synaptische eiwitten. Hier hebben we beschreven een dissectie techniek die de C. maakt elegans NMJs toegankelijk voor elektrofysiologische analyse. De bijhorende video toont de kritische stappen in de C. elegans dissectie en de typische opname configuratie gebruikt om de synaptische activiteit te meten. De drie stappen die de grootste uitdagingen in het leren van deze techniek vormen zijn: 1) de worm lijmen stap, 2) het uitvoeren van een succesvolle incisie, en 3) patchen op het lichaam muur spieren. Zodra deze zijn knie, dit preparaat vatbaar is voor de opname van de post-synaptische spieren in zowel de voltage-clamp of stroom-klem modes. Reacties op evoked stimuli kunnen gemakkelijk worden gemeten met behulp van dit ontleed voorbereiding in een verscheidenheid van mutant achtergronden. Gezien de nu al minuten grootte van de wild-type volwassen worm (1 mm in lengte), kan synaptische mutanten die niet volwassen worden of blijven mager niet vatbaar om dit dissectie aanpak. De motor neuronen van de ventrale zenuw koord zijn ook erg klein (cel soma's 2-5 micrometer) en poseren extra uitdagingen voor elektrofysiologen, hoewel een aantal laboratoria hebben met succes opgenomen van C. elegans neuronen in variaties van de ontlede voorbereiding de hier beschreven ^{5 6.}