Dissection et d'enregistrement de la jonction neuromusculaire C. Elegans

Summary

Application de l'électrophysiologie aux synapses accessible fournit une mesure quantifiable de l'activité synaptique, utiles dans l'analyse des mutants synaptique. Cet article décrit une méthode de dissection utilisée pour exposer la jonctions neuromusculaires (JNM) de

Abstract

Neurotransmission est le processus par lequel les neurones transfert d'informations via des signaux chimiques pour leurs études post-synaptique des cibles, sur une échelle de temps rapide. Ce processus complexe nécessite l'activité coordonnée de nombreuses protéines pré-et post-synaptiques appropriés pour assurer la connectivité synaptique, la conduction des signaux électriques, le ciblage et l'amorçage des vésicules de sécrétion, de détection de calcium, la fusion des vésicules, la localisation et la fonction des récepteurs post-synaptiques, et enfin, le recyclage mécanismes. Comme neuroscientifiques notre objectif est d'élucider les protéines de fonction dans chacune de ces étapes et de comprendre leurs mécanismes d'action. Enregistrements électrophysiologiques des synapses fournir une quantifiables lecture des événements sous-jacents électriques qui se produisent pendant la transmission synaptique. En combinant cette technique avec la gamme puissante d'outils moléculaires et génétiques disponibles pour manipuler les protéines synaptiques en C. elegans, nous pouvons analyser les changements résultant fonctionnelle dans la transmission synaptique.

Le C. elegans NMJs formé entre les motoneurones et paroi du corps de contrôle des muscles de locomotion, par conséquent, les mutants avec des phénotypes coordination locomotrice (connu sous le nom UNC s) souvent la transmission synaptique à ces perturbent ^une synapses. Depuis mutants unc sont maintenus sur une alimentation riche d'une source de nourriture des bactéries, elles restent viables tant qu'ils conservent une certaine capacité de pompage du pharynx à ingérer des aliments. Ceci, combiné avec le fait que C. elegans existent comme hermaphrodites, leur permet de passer sur la descendance mutante, sans la nécessité d'élaborer un comportement d'accouplement. Ces attributs, associés à notre capacité récente d'enregistrer à partir des vers NMJs ^2,3,7 rendre cet organisme modèle dans lequel une excellente pour répondre avec précision comment la neurotransmission unc l'impact des mutants.

La méthode de dissection consiste à immobiliser les vers adultes à l'aide d'une colle cyanoacrylique afin de faire une incision dans la cuticule ver exposer le NMJs. Depuis C. adultes elegans ne sont que 1 mm de longueur de la dissection est réalisée avec l'utilisation d'un microscope à dissection et nécessite une excellente coordination œil-main. JNM enregistrements sont effectués par la cellule entière de tension de serrage des cellules individuelles du corps paroi musculaire et la libération des neurotransmetteurs peuvent être évoqués en utilisant une variété de protocoles de stimulation dont la stimulation électrique, activé par la lumière canal rhodopsine médiée par la dépolarisation ⁴ et salines hyperosmotiques, qui sera brièvement décrites.

Protocol

A. Préparation des outils utilisés pour la dissection.

1. La chambre de dissection / enregistrement: En général, nous construisons notre chambre d'enregistrement dans une feuille 1 / 16 ^ème magnétiques pouces, avec un trou circulaire percé dans le centre qui est assez grand pour accueillir un diamètre de 22 mm couvercle en verre circulaire. Les dimensions extérieures de la chambre dépendra de la platine du microscope utilisé pour faire des enregistrements. Sur le verso de la feuille magnétique, nous attachons une 48 x 60 mm lamelle, laquelle nous adhérons à la chambre en plaçant une pastille de cire fondue des tissus à faible Paraplax enrobage dans chaque coin de la lamelle en sandwich entre le verre et la chambre . La cire est ensuite fondu sur une plaque chauffante, plaque de verre vers le haut, jusqu'à ce qu'elle forme une couche continue coller la lamelle de la chambre. Ne laissez pas cette étape sans assistance comme la cire fond rapidement. La chambre doit être retiré et refroidi dès que la cire a fondu. L'excès de cire qui a suinté le long du bord intérieur de la cavité circulaire 22mm peut être enlevé en utilisant un tranchant de la lame de rasoir.
2. Lamelles Sylgard revêtement: La dissection est réalisée sur un 22 mm, lamelle Sylgard revêtement qui est placé dans la cavité circulaire de la chambre d'enregistrement. Le pelage Sylgard aide de la colle cyanoacrylique adhèrent à la lamelle lors du collage des vers le bas et agit aussi comme un coussin sur lequel briser le dos de la colle la pointe de pipette quand elle devient branchée. Sylgard est composée frais selon les instructions du fabricant (10 pièces à base de silicone à 1 partie de durcisseur en poids). Une petite goutte de Sylgard est ensuite placé sur chaque lamelle et un balayage à l'aide d'un avantage lame de rasoir pour faire une surface plane. Les lamelles enduites sont placées dans de grandes plates contenants couverts et laissés dans un four à 65 ° degrés durant la nuit pour guérir.
3. Pipettes: Généralement, nous utilisons les mêmes filaments de 1 mm de diamètre extérieur en verre de borosilicate pour générer les pipettes pour les vers le bas collant, faire des incisions cuticule et enregistrement à partir de muscles, en utilisant un extracteur de l'électrode. Il est conseillé de tirer un pot de pipettes avant de tenter une dissection que cette étape peut nécessiter plusieurs échanges rapides de pipettes.
4. Applicateur de colle: Colle est chargé et appliqué à partir de la pointe d'une pipette de la colle, le bouche-pression. La pipette collage est insérée dans une extrémité d'une pièce de 2 pieds de tuyaux en polyéthylène avec un diamètre intérieur qui correspond au diamètre extérieur du verre pipette (généralement de 1 mm). L'autre extrémité du tube est titulaire d'une pointe de pipette Eppendorf qui agit comme un embout buccal.
5. Extraction pipette: Les viscères ver doit être retiré de la cavité ver une fois l'incision cuticule a été faite. Ceci est réalisé avec un morceau de tuyau attaché à une pointe de pipette Eppendorf similaire à l'applicateur de colle mais dans ce cas l'extraction de verre pipette est cassé revenir suffisamment pour permettre les œufs et les viscères pour être facilement aspirés hors de la cavité ver.

B. La dissection

1. Dans la chambre d'enregistrement d'une ligne de cire circulaires plume est établi à proximité du périmètre de la chambre à laquelle une lamelle Sylgard revêtement est pressé fermement en place (Sylgard-robe vers le haut). Cette ligne de cire immobilise la lamelle et empêche la solution d'enregistrement et de suinter sous déloger la lamelle lors de la dissection et l'enregistrement. La chambre est alors remplie avec une solution d'enregistrement extracellulaire et plusieurs vers sont placés dans le centre en utilisant un pick ver. Worms se baigner dans la solution, mais avec la pratique, ces vers peuvent être collés sans aucune autre procédure, comme le refroidissement pour empêcher le mouvement. Pendant la phase de formation, elle peut aider à la pratique des vers collage mutant dans lequel la natation est altérée (tels que UNC-31 mutants).
2. Un récipient de colle façonné à partir d'un bouchon de PCR tenue en cire ou en pâte à modeler, est utilisé pour maintenir un stock de travail de la colle cyanoacrylique. Pipettes colle avec des dimensions similaires à la pointe de la pipette d'enregistrement (normalement ~ 4 mégohms de résistance) sont utilisées pour appliquer la colle. Utilisation de l'applicateur de colle, une petite quantité de colle est aspiré dans la pipette de la colle, en utilisant le champ de dissection pour visualiser la pointe de la pipette que la colle est aspirée.
3. La colle cyanoacrylique (HistoacrylBlue, Aesulap) polymérise au contact avec une solution d'enregistrement extracellulaire, il est donc important de maintenir une pression positive sur la pipette de la colle à son entrée dans la solution de chambre pour empêcher la colle de durcir et de brancher la pipette. Dès que la pipette de la colle se trouve dans la solution de la chambre, un petit ruisseau, mais constante, de colle doit être appliquée sur la surface sous la bouche Sylgard pression de contrôle pour éviter de brancher. Si la pipette est branché, il peut parfois être débloqué en tapotant doucement la pointe sur le verre Sylgard-enduit. Il est recommandé que vous pratiquez le collage avant de tenter de les vers de la colle. Si vous ne pouvez régulièrement écrire votre nom dans la colle sur le Sylgard, avec des lettres, fait de lignes plus minces que la largeur des vers que vous êtes prêt à procEED pour le collage des cuticules ver.
4. Pour coller un ver, l'utilisation à pression positive pour attacher une petite quantité de colle soit à la tête ou la queue du ver et tirer rapidement le ver le bas sur la surface Sylgard. Essayez de joindre le ver près du centre de la chambre que les vers collés trop près du bord seront difficiles à atteindre avec des pipettes d'enregistrement. Appliquez ensuite un flux constant de colle le long du bord dorsal de la cuticule du ver de l'attachement de départ, forçant le ver dans un C-position avec la vulve vers l'intérieur (pour les enregistrements musculaire ventrale). Toutes les lacunes dans cette ligne de colle doit être rempli en sorte que le ver est fortement attaché, pour empêcher le ver de se détacher pendant l'étape de l'incision cuticule.
5. Pour faire l'incision cuticule, passer à la dissection d'une pipette à main. Cette pipette doit être plus forte que la colle / l'enregistrement des pipettes et ont une courte tige robuste. Utilisation de la plus haute grossissement sur la portée de dissection, d'aligner le parallèle pipette à l'axe longitudinal de la vis sans fin et insérez la pointe propos milieu le long de la vis sans fin (proche de la vulve) faire l'incision à l'interface cuticules / colle. Cette incision libère la pression hydrostatique vers forçant les œufs et les intestins par le point d'incision. Continuer la coupe la cuticule vers la tête du ver avec un mouvement de tranchage similaire à l'ouverture d'une lettre, jusqu'à ce que vous atteigniez le pharynx. Passer à la pipette d'extraction à vide sur les organes internes du ver. Après compensation de l'incision, la cuticule a ouvert conservera sa forme cylindrique. Utiliser une pipette encollage frais pour point de soudure du bord coupé de la cuticule vers le bas sur la surface Sylgard. Il est important d'utiliser des points de colle minimale à ce stade pour éviter d'endommager ou de masquer les NMJs.
   Les muscles ventraux du nerf mur de cordon et le corps sont désormais exposés.
6. Pour retirer la membrane basale qui couvre la NMJs, sucer la solution d'enregistrement extracellulaire de la chambre et d'appliquer la collagénase (0.4mg/ml en solution d'enregistrement extracellulaire) pour environ 10-20 secondes, retirer et laver à plusieurs reprises avec une solution d'enregistrement extracellulaire frais. Passez à l'étape de l'enregistrement.

C. patch-clamp

1. Position de la chambre d'enregistrement sur une platine de microscope en haut à droite avec un objectif 10X au centre du ver. Passez à une eau-40X émersion objectif avec DIC et vérifier que les muscles de la paroi du corps et le cordon nerveux sont intacts. Position du ver de sorte que l'axe longitudinal du ver est parallèle avec le bord avant de la portée, permettant électrodes sera introduit à partir des deux côtés de la gauche et la droite.
2. Patch du muscle en utilisant la norme patch-clamp techniques. Les électrodes d'enregistrement d'environ 4 mégohms de résistance bien travailler. Une fois que l'électrode touche la membrane musculaire, augmentation de pression négative jusqu'à ce qu'un joint gigohm est obtenu. Pour le mode de la cellule entière d'enregistrement voltage-clamp, appliquer plus d'aspiration et de zapper la membrane jusqu'à ce que le joint gigohm est rompu. Dans un bon enregistrement, muscles de la paroi du corps des vers adultes de type sauvage ont généralement une capacité de la membrane cellulaire de ~ 70 pF et peut être stablement enregistrés depuis au moins 10 minutes à un potentiel de maintien de -60 mV avec un minimum de courants de maintien (~ 50 pA).
3. La solution d'enregistrement extracellulaire se compose de (en mM): NaCl 150, KCl 5, _CaCl2 5, MgCl ₂ 4, du glucose à 10, saccharose à 5, HEPES 15 (pH 7,3, 330mOsm ~). La pipette de patch contient (en mM): KCl 120, KOH 20, MgCl ₂ 4, (N-tris [hydroxyméthyl] mthyl-2-aminoéthanethiol-sulfonique) TES 5, dihydraté _CaCl2 0,25, Na ₂ ATP 4, saccharose 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Remarque: Ces solutions artificiellement la charge cellules musculaires avec du chlorure, de sorte que le récepteur GABA-médiée courants sont étrangers à cause de l'efflux de chlorure à un potentiel de maintien de -60 mV. Variations sur ces solutions ont été utilisés (voir les publications pour les détails).
4. Evoqués communiqué. Typiquement nous plaçons une deuxième électrode contenant une solution extracellulaire sur la chaîne nerveuse ventrale antérieure au muscle patché. Cette configuration de patch en vrac doivent grande stimuli dépolarisants (de l'ordre de 10s de volts) de courte durée (1-2ms) pour atteindre maximale réponses évoquées (généralement de 2,0 à 2,5 nA) en vers de type sauvage. Les limites de cette approche sont: 1) Seules quelques réponses évoquées peuvent être livrés avant la moelle épinière est irréversiblement endommagé et 2) Pour des raisons inconnues, seulement cholinergique réponses évoquées peut être obtenue en utilisant cette configuration de stimulation.
5. Lumière activé canal rhodopsine stimulation. Récemment, le laboratoire a généré des vers Gottschalk transgéniques exprimant des algues dérivés rhodopsins canal qui dépolariser la membrane sur-stimulation de lumière dans les sous-ensembles de neurones, selon le promoteur utilisé pour diriger l'expression ^4. Dans le cas de la C. JNM elegans, les lignes intégrées exprimer canal rhodopsine soit dans les neurones moteurs cholinergiques ou neurones moteurs sont maintenant disponib GABAergiquese. Depuis le canal rhodopsine répond uniquement à la lumière quand tout-trans rétinal est associée à la fraction opsine, vers utilisés pour cette application doit être cultivé sur des bactéries lacées avec de la rétine. Une impulsion de lumière verte peut ensuite être utilisé à plusieurs reprises activer la rhodopsine canaux provoquant la libération évoquée d'acétylcholine soit ou GABA, selon lesquelles les vers transgéniques sont utilisées. Ces vers transgénique peut être franchi dans les souches mutantes. L'avantage de cette technique par rapport à la stimulation précédente électriques comprennent: 1) Lumière-activation ne provoque pas de lésions neuronales, permettant des stimulations répétées de nombreux à effectuer et 2) évoqués libération de deux neurones moteurs GABAergiques ou cholinergiques peuvent être indépendamment étudiés.
6. Hyperosmotiques induite par la libération. Pour mesurer la taille de la piscine vésicules facilement libérable (reflétant la piscine résumé des vésicules apprêté de tous les JNM sur le muscle enregistré), une pression pipette contenant hyperosmotiques solution extracellulaire (ajusté à ~ 850 mOsm par addition de saccharose supplémentaires) est utilisé. Pression d'impulsion des applications de 1-3 secondes de produire un barrage de asynchrones post-synaptique des événements en utilisant les solutions standard décrit ci-dessus.

Figure 1: Présentation schématique de la C. Dissection elegans et la configuration d'enregistrement neuromusculaire

Une lamelle Sylgard revêtement faite en enduisant une goutte de Sylgard à travers le verre et le durcissement est nuit placée dans la cavité circulaire de la chambre d'enregistrement préfabriqués et couvert avec une solution d'enregistrement. Un ver placé dans le centre est collé à la surface Sylgard à partir de la tête ou la queue, appliquer la colle sur la face dorsale du ver, en utilisant une pipette de la colle,. Une fois le collage est terminé, une incision à côté de la vulve, à l'interface entre la cuticule et de la colle est faite avec une aiguille de verre et étendu vers la tête (voir la ligne rouge perforé). Suite à l'extraction des viscères et les œufs de la cavité du corps, le bord coupé de l'incision est soudée avec de la colle à l'exposant le Sylgard nerveuse ventrale (en vert) et muscles de la paroi du corps (en rouge). Le muscle ventral-médiale antérieure à la vulve est patch-serré et l'électrode de stimulation est placée en amont sur la moelle épinière.

Les résultats représentatifs

Cellules entières, tension serré enregistrements paroi musculaire du corps sont présentés pour chacun des trois protocoles de stimulation décrit ci-dessus (électriquement évoqués, la lumière et les réponses évoquées hyperosmotiques). Dans tous les cas, le muscle ventral-médiale du corps mur est serré à -60 mV. Cellules musculaires A. type sauvage présentent généralement des taux élevés de l'intérieur endogènes miniatures courants synaptiques dans nos solutions d'enregistrement standard. B. Une dépolarisation 2ms de la corde nerveuse ventrale antérieure provoque la libération synchrone de plusieurs synapses résultant en une réponse de grande d'environ 2 à 2,5 évoqué nA vers de type sauvage. Représentant des traces à la droite des traces de type sauvage dans A et B montrent la libération synaptique dans un grave manque de coordination mutant (UNC-18). Panel C montre une réponse légère évoquée à partir de la jonction neuromusculaire d'un ver de type sauvage exprimant le canal rhodopsine dans les neurones cholinergiques. Une impulsion de lumière 2ms produit typiquement une réponse de 1.5 à 1.8 nA. D. pression d'éjection de 850 mOsm salines hyperosmotiques sur le muscle pour 1s, produit un barrage asynchrone des miniatures représentant des courants synaptiques de la piscine facilement libérable de vésicules.

Discussion

La génétique organisme modèle C. elegans est idéalement adapté pour l'étude de la transmission synaptique, à travers l'analyse fonctionnelle des mutations dans des gènes codant pour des protéines synaptiques. Ici, nous avons décrit une technique de dissection qui rend le C. elegans NMJs accessibles pour l'analyse électrophysiologique. La vidéo d'accompagnement décrit les étapes critiques dans le C. Dissection elegans et la configuration d'enregistrement typique utilisée pour mesurer l'activité synaptique. Les trois étapes qui posent les plus grands défis dans l'apprentissage de cette technique sont: 1) l'étape de collage ver, 2) effectuer une incision de succès, et 3) sur les correctifs à l'muscles de la paroi du corps. Une fois ces ont été maîtrisées, cette préparation est prête à l'enregistrement du muscle post-synaptique soit dans le voltage-clamp ou courant-clamp modes. Les réponses aux stimuli évoqués peuvent être facilement mesurés en utilisant cette préparation disséqués dans une variété de milieux mutant. Compte tenu de la taille déjà minute du ver adulte de type sauvage (1 mm de longueur), les mutants synaptiques qui n'atteignent pas l'âge adulte ou rester maigrichon peut ne pas se prêter à cette approche de dissection. Les neurones moteurs de la moelle nerveuse ventrale sont également très faible (cellule de Soma 2-5 um) et posent des défis supplémentaires pour les électrophysiologistes, bien que plusieurs laboratoires ont réussi enregistrées à partir de C. neurones elegans dans les variations de la préparation disséqué décrites ici ^{5 6.}