Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Summary

Die Anwendung der Elektrophysiologie, barrierefreie Synapsen eine quantifizierbare Messung der synaptischen Aktivität, nützlich bei der Analyse synaptischer Mutanten. Dieser Artikel beschreibt ein Dissektion Methode verwendet, um die motorischen Endplatten (NMJ) von expose

Abstract

Neurotransmission ist der Prozess, durch den Nervenzellen übertragen Informationen über chemische Signale an ihre postsynaptischen Ziele, auf einer schnellen Zeitskala. Dieser komplexe Prozess erfordert die koordinierte Aktivität von vielen Vor-und post-synaptischen Proteinen, geeignete synaptischer Verbindungen, Durchführung von elektrischen Signalen, Targeting und Grundieren von sekretorischen Vesikeln, Calcium-sensitiven, Vesikelfusion, Lokalisation und Funktion von postsynaptischen Rezeptoren zu gewährleisten und schließlich das Recycling Mechanismen. Wie Neurowissenschaftler ist es unser Ziel, aufzuklären, welche Proteine ​​Funktion in jedem dieser Schritte und verstehen ihre Wirkmechanismen. Elektrophysiologischen Ableitungen von Synapsen eine quantifizierbare aus dem zugrunde liegenden elektrischen Ereignisse, die während der synaptischen Übertragung auftreten zu lesen. Durch die Kombination dieser Technik mit dem leistungsstarken Reihe von molekularen und genetischen Werkzeuge zur Verfügung, synaptischer Proteine ​​in C. manipulieren elegans, können wir analysieren die daraus resultierenden funktionellen Veränderungen der synaptischen Übertragung.

Die C. elegans NMJs gebildet zwischen Motoneuronen und Körper Wand Muskeln kontrollieren Fortbewegung, also Mutanten mit unkoordinierten Bewegungsapparates Phänotypen (bekannt als unc s) oft stören synaptischen Übertragung an diesen Synapsen ^1. Da unc Mutanten auf ein reichhaltiges Angebot an einer bakteriellen Nahrungsquelle erhalten bleiben, bleiben sie umsetzbar, solange sie einige Rachenraum Pumpen Fähigkeit, Nahrung aufnehmen zu behalten. Dies, zusammen mit der Tatsache, dass C. elegans existieren als Zwitter, können sich auf mutierten Nachkommen ohne die Notwendigkeit für aufwendige Paarungsverhalten passieren. Diese Attribute, mit unserem jüngsten Fähigkeit, von den Würmern Rekord NMJs ^2,3,7 machen dieses ein hervorragendes Modell Organismus, in dem genau wie unc Mutanten Auswirkungen Neurotransmission Adresse gekoppelt.

Die Dissektion Methode besteht darin Immobilisierung erwachsenen Würmer mit einem Cyanoacrylsäure Leim, um einen Einschnitt in der Wurm Nagelhaut Freilegung der NMJs machen. Da C. elegans Erwachsene zahlen nur 1 mm in der Länge der Dissektion mit dem Einsatz von einem Binokular durchgeführt und erfordert gute Hand-Auge-Koordination. NMJ Aufnahmen werden durch whole-cell Spannungsbegrenzung einzelnen Körper Wand Muskelzellen und die Freisetzung von Neurotransmittern können evozierte mit einer Vielzahl von Stimulationsprotokolle einschließlich elektrischer Stimulation, Licht-aktivierte Kanal-Rhodopsin-vermittelte Depolarisation ⁴ und hyperosmotischen Kochsalzlösung, die alle sein wird gemacht werden kurz beschrieben.

Protocol

A. Herstellung von Werkzeugen für die Präparation verwendet.

1. Die Dissektion / Aufnahme Kammer: Wir in der Regel konstruieren unsere Aufnahme Kammer aus einem 1 / 16 ^th Zoll Magnetfolie, mit einem kreisrunden Loch in der Mitte, die groß genug für einen 22 mm Durchmesser runden Deckglas Platz gebohrt. Die äußeren Abmessungen der Kammer wird auf dem Mikroskoptisch verwendet werden, um die Aufnahmen abhängen. Auf der Rückseite der Magnetfolie, legen wir eine 48 x 60 mm Deckglas, das wir in die Kammer halten, indem man ein Pellet aus niedrigen Schmelz Paraplax Gewebe eingebettet Wachs in jeder Ecke des Deckglases eingeklemmt zwischen dem Glas und der Kammer . Das Wachs wird dann auf einer heißen Platte geschmolzen, Glasplatte nach oben, bis es eine durchgehende Schicht kleben das Deckglas auf die Kammer bildet. Lassen Sie diesen Schritt unbeaufsichtigt wie das Wachs schmilzt schnell. Die Kammer sollte entfernt und gekühlt werden, sobald das Wachs geschmolzen ist. Überschüssiges Wachs, das entlang der Innenkante des 22mm kreisförmigen Hohlraum eingedrungen ist, kann entfernt mit einer Rasierklinge Kante.
2. Sylgard-beschichtete Deckgläser: Die Präparation wird auf einem 22 mm, Sylgard-beschichteten Deckglas, dass innerhalb der kreisförmigen Hohlraum der Aufnahme Kammer platziert durchgeführt wird. Die Sylgard Mantel hilft dem Cyanoacrylsäure Kleber, um die Abdeckung halten Schlupf beim Verkleben der Würmer nach unten und dient auch als Kissen, auf dem Bruch wieder auf den Leim Pipettenspitze, wenn es angeschlossen wird. Sylgard wird frisch zubereitet nach den Anweisungen des Herstellers (10 Teile Silikon-Basis zu 1 Teil Härter nach Gewicht). Ein kleiner Tropfen Sylgard wird dann auf jeder Deckglas gelegt und schmierte über mit einer Rasierklinge Rand, um eine gleichmäßige Oberfläche zu machen. Die beschichteten Deckgläser sind in großen, flachen, abgedeckten Behältern gestellt und in einem 65 °-Grad-Ofen über Nacht aushärten.
3. Pipetten: In der Regel verwenden wir die gleiche 1 mm Außendurchmesser Filament Borosilikatglas, um die Pipetten zum Kleben Würmer unten zu erzeugen, so dass Nagelhaut Einschnitte und die Aufnahme von Muskeln, mit Hilfe einer Elektrode Abzieher. Es ist ratsam, ein Glas Pipetten, bevor er eine Präparation wie dieser Phase mehrere schnellen Austausch von Pipetten erfordern ziehen kann.
4. Leimgerät: Glue ist geladen und angewendet von der Spitze eines Klebers Pipette, durch Mund-Druck. Die Verklebung Pipette wird in das eine Ende eines 2 Fußstück aus Polyethylen-Schlauch mit einem Innendurchmesser, der Außendurchmesser der Pipette Glas (in der Regel 1 mm) passt eingefügt. Das andere Ende des Schlauches hat einen eppendorf Pipettenspitzen, die als Mundstück dient.
5. Extraction Pipette: Der Wurm Eingeweide sind von dem Wurm Hohlraum entfernt werden, wenn die Nagelhaut Schnitt gemacht worden ist. Dies ist mit einem Stück Schlauch an einer Eppendorf Pipette ähnlich dem Leimgerät aber in diesem Fall das Glas Extraktion Pipettenspitze ist wieder ausreichend gebrochen, damit Eier und Innereien einfach abgesaugt werden von dem Wurm Hohlraum erreicht.

B. Die Dissektion

1. In der Aufzeichnung Kammer eine kreisförmige Wachsschreiber Linie liegt in der Nähe des Umfangs der Kammer zu dem ein Sylgard-beschichteten Deckglas fest sitzt gedrückt (Sylgard-Mantel nach oben) gezogen. Dieses Wachs Linie immobilisiert das Deckglas und verhindert das Eindringen von Recording-Lösung unter und verdrängen das Deckglas beim Präparieren und Aufnahme. Die Kammer wird dann mit extrazellulären Recording-Lösung gefüllt und mehrere Würmer sind in der Mitte mit einem Wurm holen platziert. Worms wird in der Lösung schwimmen, aber mit der Praxis können diese Würmer sich ohne weitere Verfahren wie Kühlung, um Bewegung zu verhindern geklebt werden. Während der Ausbildung der Bühne, kann es helfen, Kleben mutierten Würmer, in denen Schwimmen beeinträchtigt wird (z. B. unc-31-Mutanten) Praxis.
2. Ein Leimbehälter aus einer PCR-Cap in Wachs oder Plastilin statt fashioned, wird verwendet, um eine Arbeitsgruppe eine Bestandsaufnahme der Cyanoacrylsäure Leim halten. Kleber Pipetten mit ähnlichen Tipp Dimensionen, um die Aufnahme Pipetten (normalerweise ~ 4 MOhm Widerstand) werden verwendet, um Klebstoff anwenden. Mit dem Leimgerät, wird eine kleine Menge der Leim in die Leim-Pipette angesaugt, über die Sezierung Rahmen der Pipettenspitze zu visualisieren, wie der Kleber aufgesaugt.
3. Die Cyanoacrylsäure Kleber (HistoacrylBlue, Aesulap) polymerisiert bei Kontakt mit extrazellulären Recording-Lösung, daher ist es wichtig, positive Druck auf den Leim Pipette zu halten, wie es die Kammer Lösung tritt der Klebstoff von Härten zu vermeiden und Einstecken der Pipette. Sobald der Leim Pipette in die Kammer-Lösung ist, muss eine kleine, aber konstanten Strom von Klebstoff auf die Oberfläche unter Sylgard Mund-Druckregelung zu verhindern Verstopfung angewendet werden. Wenn die Pipette verstopft es manchmal durch leichtes Antippen der Spitze auf dem Sylgard-beschichtetes Glas entsperrt werden. Es wird empfohlen, dass Sie Verkleben der Praxis, bevor Sie Leim Würmer. Wenn Sie regelmäßig schreiben können Ihren Namen in Leim auf die Sylgard, mit Briefen von Linien dünner als die Würmer Breite hergestellt sind Sie bereit, proceed dem Verkleben der Wurm Nagelhaut.
4. Zum Kleben ein Wurm, verwenden Sie positive Druck, eine kleine Menge des Klebers, um entweder den Kopf oder Schwanz des Wurmes legen und schnell zu zeichnen der Wurm nach unten auf die Sylgard Oberfläche. Versuchen Sie, den Wurm in der Nähe der Mitte der Kammer anbringen, wie Würmer geklebt zu nahe an den Rand wird schwierig sein, mit der Aufnahme Pipetten zu erreichen. Dann bewerben Sie sich ein konstanter Strom von Kleber entlang der dorsalen Kante des Wurms Nagelhaut vom Ausgangspunkt Anlage, wodurch der Wurm in eine C-Position mit der Vulva nach innen (zum ventralen Muskel-Aufnahmen). Allfällige Lücken in diesem Leimfuge sollte so gefüllt werden, dass der Wurm stark befestigt ist, um den Wurm nicht abgehängt werden während der Nagelhaut Schnitt Schritt zu verhindern.
5. Um die Nagelhaut Schnitt, eine Hand-Dissektion Pipette wechseln. Diese Pipette muss schärfer als der Kleber / Aufnahme Pipetten und haben einen kurzen, stabilen Schaft. Mit der höchsten Vergrößerung auf dem Binokular, richten Sie die Pipette parallel zur Längsachse des Wurms und legen Sie die Spitze über Mittelpunkt entlang der Wurm (in der Nähe der Vulva) der an den Schnitt an der Nagelhaut / Leim-Schnittstelle. Dieser Schnitt gibt die Würmer hydrostatischen Druck zwingt Eier und Darm durch den Schnitt Punkt. Weiter Schneiden der Nagelhaut in Richtung Kopf des Wurms mit einem Schneidebewegung ähnlich wie bei einem Brief öffnen, bis Sie den Rachen gelangen. Schalten Sie um auf die Extraktion Pipette absaugen die inneren Organe des Wurms. Nach dem Löschen des Schnittes wird die Schuppenschicht geöffnet halten es zylindrische Form. Verwenden Sie einen Frischkleben Pipette Schweißpunkt die Schnittkante der Kutikula nach unten auf die Sylgard Oberfläche. Es ist wichtig, minimal Leimpunkte in dieser Phase nutzen, um eine Beschädigung oder Verschleierung der NMJs.
   Das Bauchmark und Körper Wand Muskeln sind nun frei.
6. Um die Basalmembran, die NMJs Abdeckungen entfernen, absaugen der extrazellulären Recording-Lösung aus der Kammer und gelten Kollagenase (0.4mg/ml in extrazellulären Recording-Lösung) für ca. 10-20 Sekunden, abnehmen und waschen mehrmals mit frischem extrazellulären Recording-Lösung. Fahren Sie mit der Aufzeichnung der Bühne.

C. Patch-Clamp Aufnahme

1. Position der Aufnahme Kammer auf einem oben rechts Mikroskoptisch mit einer 10X-Objektiv zur Mitte des Wurms. Wechseln Sie zu einem 40x Wasser-emersion Ziel mit DIC und überprüfen Sie, dass der Körper Wand Muskeln und Nervenstränge intakt sind. Positionieren Sie den Wurm so, dass die Längsachse des Wurms parallel mit der vorderen Kante des Anwendungsbereichs ist, so dass Elektroden sowohl aus dem linken und rechten Seite eingeführt werden.
2. Patch der Muskel mit Standard-Patch-Clamp-Techniken. Recording-Elektroden von ca. 4 MOhm Widerstand gut zu funktionieren. Nachdem die Elektrode berührt die Muskel-Membran, erhöhen Unterdruck-bis ein gigohm Siegel erhalten. Für die whole-cell Voltage-Clamp-Aufnahmemodus, wenden Sie mehr Saug-und zap die Membran, bis die gigohm Siegel gebrochen ist. In eine gute Aufnahme, Körper Wand Muskeln Wildtyp erwachsenen Würmer haben typischerweise eine Zellmembran Kapazität von ca. 70 pF und stabil für mindestens 10 Minuten in einem Betrieb von -60 mV bei minimaler Halteströme (~ 50 erfasst pA).
3. Die extrazelluläre Recording-Lösung besteht aus (in mM): NaCl 150, KCl 5, CaCl ₂ 5, MgCl ₂ 4, Glucose 10, Saccharose 5, HEPES 15 (pH 7,3, ~ 330mOsm). Die Patch-Pipette enthält (in mM): KCl 120, KOH 20, MgCl ₂ 4, (N-Tris [hydroxymethyl] mthyl-2-amino-sulfonsäure) TES 5, Dihydrat CaCl ₂ 0,25, Na ₂ ATP 4, Saccharose 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Hinweis: Diese Lösungen künstlich Last Muskelzellen mit Chlorid, so dass die GABA-Rezeptor-vermittelten Ströme nach innen durch Chlorid-Efflux in einem Betrieb von -60 mV. Variationen über diese Lösungen verwendet wurden (siehe Publikationen für Details).
4. Evozierte Freisetzung. Normalerweise legen wir eine zweite Elektrode, die extrazelluläre Lösung auf dem Bauchmark ventral des gepatchten Muskel. Diese lose Patch-Konfiguration erfordert große depolarisierende Stimuli (in der Größenordnung von 10s Volt) nur von kurzer Dauer (1-2ms) bis zur maximalen evozierte Potentiale (typischerweise 2,0-2,5 nA) in Wildtyp-Würmern zu erreichen. Die Grenzen dieses Ansatzes sind: 1) Nur ein paar evozierte geliefert werden können, bevor der Nervenstrang irreversibel geschädigt ist und 2 sein) Aus unbekannten Gründen kann nur cholinerge evozierte Potentiale hervorgerufen werden durch diese Stimulation Konfiguration.
5. Licht aktivierten Kanal-Rhodopsin Stimulation. Vor kurzem hat die Gottschalk-Labor transgenen Würmer Ausdruck Algen-derived Kanal Rhodopsine, dass die Membran über Licht-Stimulation depolarisieren in Teilmengen von Neuronen, abhängig von der verwendeten Promotor zur Expression ^4-Laufwerk. Erzeugten Im Fall des C. elegans NMJ sind integrierte Linien auszudrücken Kanal Rhodopsin entweder in der cholinergen Motoneuronen oder GABAergen Motoneuronen jetzt verfügbe. Da Kanal Rhodopsin reagiert nur auf Licht, wenn all-trans-Retinal mit dem Opsin Einheit verknüpft ist, müssen Würmer für diese Anwendung eingesetzt auf Bakterien mit retinalen geschnürt angebaut werden. Ein grünes Licht Impuls kann dann verwendet werden, um wieder zu aktivieren den Kanal Rhodopsin verursacht evozierte Freisetzung von ACh entweder oder GABA, je nachdem, welche transgenen Würmern verwendet werden. Diese transgenen Würmer können in Mutanten gekreuzt werden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber dem Vorjahr elektrische Stimulation sind: 1) Light-Aktivierung nicht zu neuronalen Schäden, so dass viele wiederholen Stimulationen durchgeführt werden und 2) evozierte Freisetzung von beiden GABAerge oder cholinergen Motoneuronen können unabhängig voneinander studiert werden.
6. Hyperosmotischen-induzierten Freisetzung. Um die Größe der leicht lösbare Vesikel Pool (was die summiert Pool von grundierten Vesikel aus allen NMJ ist auf die aufgenommene Muskel), ein Druck-Pipette mit hyperosmotischen extrazellulären Lösung (eingestellt auf ~ 850 mOsm, indem zusätzliche Saccharose) wird verwendet, zu messen. Druck-Puls-Anwendungen von 1-3 Sekunden erzeugen eine Flut von asynchronen postsynaptischen Ereignisse unter Verwendung des Standard-Lösungen beschrieben.

Abbildung 1: Schematische Übersicht über die C. elegans Dissektion und neuromuskuläre Aufnahme-Konfiguration

Ein Sylgard beschichteten Deckglas durch Verschmieren ein Tropfen Sylgard über das Glas und Aushärtung gemacht über Nacht in den kreisförmigen Hohlraum der vorgefertigten Aufnahme Kammer gelegt und mit Recording-Lösung. Ein Wurm in der Mitte platziert ist, die Sylgard geklebt ab dem Kopf oder Schwanz, Aufbringen von Klebstoff auf der Rückenseite des Wurms mit einem Kleber Pipette. Sobald Kleben abgeschlossen ist, einen Einschnitt neben der Vulva, an der Schnittstelle zwischen der Oberhaut und Leim wird mit einem Glas Nadel gemacht und erweitert auf den Kopf (siehe rote perforierten Linie). Nach Extraktion der Eingeweide und Eier aus der Körperhöhle, ist die Schnittkante des Einschnitts punktgeschweißt mit Leim auf die Sylgard Freilegung der ventralen Nerven (grün) und Körper Wand Muskeln (rot). Die ventral-medial Muskel anterior der Vulva ist Patch-geklemmt und der stimulierenden Elektrode vorgeschaltet ist am Nervenstrang platziert.

Repräsentative Ergebnisse

Whole-cell-, Spannungs-geklemmt Körperwand Muskel-Aufnahmen sind für jede der drei Stimulationsprotokolle oben beschrieben (elektrisch evozierte, Licht-evozierte und hyperosmotischen Antworten) gezeigt. In allen Fällen ist die ventral-medial Körperwand Muskel ist bei -60 mV geklemmt. A. Wild-Typ Muskelzellen weisen typischerweise hohe endogene innen Miniatur-synaptischen Ströme in unseren Standard-Recording-Lösungen. B. A 2 ms Depolarisation des vorderen Bauchmark Ursachen synchrone Freisetzung aus mehreren Synapsen was zu einer großen evozierte Potentiale von rund 2-2,5 nA in Wildtyp-Würmer. Vertreter Spuren auf der rechten Seite des Wildtyp-Spuren in A und B zeigen synaptische Freisetzung in einem stark unkoordinierten Mutante (unc-18). Panel C zeigt eine Licht-evozierte Potentiale aus der neuromuskulären Synapse von einem Wildtyp-Wurm Ausdruck Kanal Rhodopsin in cholinergen Neuronen. A 2 ms Lichtpuls erzeugt typischerweise eine Antwort von 1,5-1,8 nA. D. Druck-Ausstoß von 850 mOsm hyperosmotischen Kochsalzlösung auf den Muskel für 1s produziert eine asynchrone Flut von Miniatur-synaptischen Ströme, die die leicht lösbare Pool von Vesikeln.

Discussion

Die genetischen Modellorganismus C, elegans ist ideal für die Untersuchung der synaptischen Übertragung geeignet, durch die funktionelle Analyse von Mutationen in Genen, synaptischer Proteine. Hier haben wir eine Dissektionstechnik, dass die C macht beschriebenen elegans NMJs zugänglich für elektrophysiologische Analysen. Das dazugehörige Video zeigt die wichtigsten Schritte in der C. elegans Dissektion und die typische Aufnahme-Konfiguration verwendet werden, um synaptische Aktivität zu messen. Die drei Schritte, die zu den größten Herausforderungen in Erlernen dieser Technik darstellen; 1) der Wurm Beleimungsschritt, 2) die Durchführung einer erfolgreichen Einschnitt, und 3) Patchen auf die Wand des Körpers Muskeln. Sobald diese gemeistert haben, wird dies Vorbereitung offen für die Aufnahme der postsynaptischen Muskel entweder in der Voltage-Clamp-oder Current-Clamp-Modi. Responses to evozierten Stimuli kann leicht gemessen werden mit dieser seziert die Zubereitung in einer Vielzahl von Mutanten-Hintergründen. Angesichts der bereits geringen Größe des Wildtyp-erwachsenen Wurm (1 mm in der Länge), kann synaptischen Mutanten, die nicht bis ins Erwachsenenalter oder bleiben dürr nicht zugänglich sein, diese Zerlegung Ansatz. Die motorischen Neuronen des Bauchmarks sind auch sehr klein (Zelle soma ist 2-5 um) und stellen zusätzliche Herausforderungen für Elektrophysiologen, obwohl mehrere Labors erfolgreich von C. aufgenommen haben elegans Neuronen in Variationen der sezierten Vorbereitung hier beschriebenen ^{5 6.}