सी एलिगेंस Neuromuscular जंक्शन से विदारक और रिकॉर्डिंग

Summary

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की सुलभ synapses के लिए आवेदन synaptic गतिविधि का एक quantifiable उपाय, synaptic म्यूटेंट विश्लेषण में उपयोगी प्रदान करता है. यह लेख एक विच्छेदन neuromuscular (NMJ) जंक्शनों को बेनकाब करने के लिए इस्तेमाल किया विधि का वर्णन

Protocol

ए विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों की तैयारी.

1. विच्छेदन / रिकॉर्डिंग कक्ष: हम आम तौर पर एक परिपत्र केंद्र है कि काफी बड़े के लिए एक 22 मिमी व्यास परिपत्र कवर गिलास को समायोजित है में drilled छेद के साथ एक 1 ^/ 16 वें इंच चुंबकीय पत्रक के हमारे रिकॉर्डिंग कक्ष का निर्माण. चैम्बर के बाहरी आयामों रिकॉर्डिंग करने के लिए इस्तेमाल किया खुर्दबीन मंच पर निर्भर करेगा. चुंबकीय पत्रक के रिवर्स साइड पर, हम एक 48 x 60 मिमी को कवर पर्ची, जो हम कवर के प्रत्येक कोने में कम पिघल Paraplax ऊतक एम्बेड मोम की एक गोली रखकर कक्ष का पालन देते कांच और कक्ष के बीच sandwiched पर्ची . मोम तो एक गर्म थाली पर पिघल गिलास प्लेट सामना करना पड़ रहा है, जब तक यह एक सतत परत चैम्बर कवर करने के लिए पर्ची gluing रूपों. के रूप में मोम जल्दी पिघला देता है इस कदम पहुंच से बाहर छोड़ मत करो. कक्ष और हटाया जाना चाहिए जैसे ही मोम पिघल गया है ठंडा है. अतिरिक्त मोम कि 22mm परिपत्र गुहा के भीतर की बढ़त के साथ seeped है एक रेजर ब्लेड बढ़त का उपयोग कर हटाया जा सकता है है.
2. Sylgard लेपित कवर फिसल जाता है: विच्छेदन एक 22 मिमी, Sylgard लेपित कवर पर्ची है कि रिकार्डिंग कक्ष के परिपत्र गुहा के भीतर रखा जाता है पर प्रदर्शन है. Sylgard कोट में मदद करता है cyanoacrylic गोंद कवर करने के लिए पालन पर्ची gluing जब एक तकिया है जिस पर वापस गोंद विंदुक टिप को तोड़ने के लिए जब यह खामियों को दूर हो जाता है नीचे और भी कीड़े के रूप में कार्य करता है. Sylgard बना के अनुसार ताजा निर्देशों (10 भागों सिलिकॉन आधार वजन से एजेंट के इलाज के लिए 1 हिस्सा) बनाती है. Sylgard की एक छोटी सी बूंद तो प्रत्येक कवर पर्ची पर रखा गया है और एक रेजर ब्लेड बढ़त का उपयोग करने के लिए एक भी सतह बनाने भर में लिप्त है. लेपित कवर फिसल जाता है बड़े फ्लैट कवर कंटेनर में रखा जाता है और एक 65 ° डिग्री इलाज रातोंरात ओवन में छोड़ दिया.
3. Pipettes: आमतौर पर, हम एक ही 1 मिमी बाहरी व्यास फिलामेंट borosilicate ग्लास का उपयोग करने के लिए नीचे gluing के कीड़े के लिए pipettes उत्पन्न, मांसपेशियों से छल्ली चीरों और रिकॉर्डिंग बनाने, एक इलेक्ट्रोड खींचने का उपयोग. यह सलाह दी जाती है के रूप में इस स्तर pipettes के कई तेजी से आदान - प्रदान की आवश्यकता कर सकते हैं एक विच्छेदन के प्रयास में पहले pipettes का एक जार खींच है.
4. गोंद applicator: गोंद भरी हुई है और एक गोंद विंदुक की नोक से मुँह दबाव से लागू है. gluing विंदुक एक आंतरिक व्यास है कि विंदुक कांच (आमतौर पर 1 मिमी) के बाहरी व्यास से मेल खाता है के साथ एक फुट 2 इंच टुकड़ा polyethylene टयूबिंग के एक छोर में डाला जाता है. टयूबिंग के दूसरे छोर एक Eppendorf विंदुक टिप है कि एक मुँह टुकड़ा के रूप में कार्य करता है रखती है.
5. एक्सट्रैक्शन विंदुक: कीड़ा आंत कीड़ा गुहा से हटाया जाना चाहिए एक बार छल्ली चीरा किया गया है. यह एक Eppendorf विंदुक गोंद applicator के लिए इसी तरह की टिप से जुड़ी है लेकिन इस मामले में कांच निष्कर्षण विंदुक टिप वापस टूट गया है पर्याप्त रूप से अंडे और आंत आसानी से कीड़ा गुहा के बाहर vacuumed की अनुमति टयूबिंग की एक टुकड़ा के साथ हासिल की है.

विच्छेदन बी

1. रिकार्डिंग कक्ष में एक परिपत्र मोम कलम लाइन बंद चैम्बर के लिए जो एक कवर Sylgard लेपित पर्ची दृढ़ता जगह में दबाया जाता है (Sylgard कोट ऊपर का सामना करना पड़ रहा) की परिधि के लिए तैयार है. यह मोम लाइन कवर पर्ची immobilizes और रिकॉर्डिंग समाधान तहत रिसाव और विच्छेदन और रिकॉर्डिंग के दौरान कवर पर्ची dislodging से रोकता है. चैम्बर तब बाह्य रिकॉर्डिंग समाधान के साथ भरा है और कई कीड़े एक कीड़ा लेने का उपयोग करने के केंद्र में रखा जाता है. कीड़े समाधान में तैर जाएगा, लेकिन अभ्यास के साथ, इन कीड़े ऐसे आंदोलन को रोकने ठंडा के रूप में किसी भी आगे की प्रक्रियाओं के बिना नीचे चिपके कर सकते हैं. प्रशिक्षण चरण के दौरान, यह gluing उत्परिवर्ती कीड़े जो तैराकी में बिगड़ा हुआ है (जैसे unc-31 म्यूटेंट) अभ्यास में मदद कर सकते हैं .
2. एक गोंद एक पीसीआर मोम या क्ले मॉडलिंग में आयोजित टोपी ढंग से कंटेनर, cyanoacrylic गोंद का एक काम शेयर पकड़ के लिए प्रयोग किया जाता है. रिकॉर्डिंग pipettes के लिए इसी तरह की टिप आयामों के साथ गोंद pipettes (सामान्य प्रतिरोध ~~ 4 megohms) गोंद लागू किया जाता है. गोंद applicator का प्रयोग, गोंद की एक छोटी राशि गोंद पिपेट में चूसा है, विच्छेदन गुंजाइश का उपयोग विंदुक टिप कल्पना के रूप में गोंद चूसा है.
3. cyanoacrylic गोंद (HistoacrylBlue, Aesulap) कोशिकी रिकॉर्डिंग समाधान के साथ संपर्क पर polymerizes है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है गोंद विंदुक पर सकारात्मक दबाव बनाए रखने के लिए है के रूप में यह चैम्बर समाधान प्रवेश करने के लिए सख्त से गोंद को रोकने और विंदुक plugging. जैसे ही गोंद विंदुक कक्ष समाधान में है, गोंद की एक छोटी लेकिन निरंतर प्रवाह Sylgard सतह पर मुँह दबाव को plugging को रोकने के नियंत्रण के तहत लागू किया जाना चाहिए. यदि विंदुक खामियों को दूर हो जाता है, यह कभी कभी धीरे sylgard लेपित गिलास पर टिप दोहन द्वारा unblocked जा सकता है. यह अनुशंसा की जाती है कि आप गोंद कीड़े के लिए प्रयास करने से पहले gluing अभ्यास. यदि आप नियमित रूप से Sylgard पर गोंद में अपना नाम लिख सकते हैं कीड़े चौड़ाई की तुलना में पतली लाइनों के किए गए पत्र के साथ, आप proc करने के लिए तैयार हैंकीड़ा छल्ली gluing के लिए eed.
4. एक कीड़ा गोंद करने के लिए, सकारात्मक दबाव का उपयोग करने के लिए या तो सिर या कीड़ा की पूंछ के लिए गोंद की एक छोटी राशि देते हैं और तेजी से Sylgard सतह पर कीड़ा नीचे आकर्षित. चैम्बर के केन्द्र के निकट कृमि देते हैं किनारे करने के लिए पास के रूप में कीड़े भी चिपके रिकॉर्डिंग pipettes के साथ तक पहुँचने के लिए मुश्किल हो जाएगा की कोशिश करो. फिर शुरू लगाव से कीड़ा छल्ली के पृष्ठीय बढ़त के साथ गोंद के एक निरंतर प्रवाह को लागू करने के लिए, आवक का सामना करना पड़ रहा योनी (उदर मांसपेशी रिकॉर्डिंग के लिए) के साथ एक सी स्थिति में कीड़ा मजबूर. इस गोंद लाइन में किसी भी अंतराल में तो भरा होना चाहिए कि कीड़ा दृढ़ता से जुड़ा हुआ है, छल्ली चीरा कदम के दौरान detaching से कृमि को रोकने.
5. छल्ली चीरा बनाने के लिए, एक हाथ से आयोजित विच्छेदन विंदुक के लिए स्विच करें. यह विंदुक गोंद / रिकॉर्डिंग pipettes से तेज हो सकता है और एक छोटी, मजबूत शाफ्ट की जरूरत है. विदारक गुंजाइश पर उच्चतम - बढ़ाई का प्रयोग, कृमि के अनुदैर्ध्य अक्ष विंदुक समानांतर संरेखित करें और कीड़ा (योनी के लिए करीब) इंटरफ़ेस / छल्ली गोंद पर चीरा के साथ मध्य के बारे में टिप सम्मिलित. यह चीरा कीड़े हीड्रास्टाटिक दबाव अंडे और आंतों चीरा बिंदु के माध्यम से बाहर मजबूर विज्ञप्ति. कृमि के सिर की दिशा में एक टुकड़ा करने की क्रिया एक पत्र खोलने के लिए इसी तरह की गति के साथ छल्ली काटने जारी रखें, जब तक आप ग्रसनी तक पहुँचते हैं. निष्कर्षण विंदुक पर स्विच कृमि के आंतरिक अंगों के लिए बाहर वैक्यूम. चीरा समाशोधन के बाद, खोला छल्ली यह बेलनाकार आकार बनाए रखने जाएगा. एक ताजा gluing विंदुक प्रयोग छल्ली की कटौती बढ़त Sylgard सतह पर नीचे वेल्ड हाजिर. यह महत्वपूर्ण है इस स्तर पर कम से कम गोंद स्पॉट का उपयोग करने के लिए हानिकारक या NMJs obscuring से बचने है.
   उदर तंत्रिका कॉर्ड और शरीर दीवार मांसपेशियों अब उजागर कर रहे हैं.
6. तहखाने झिल्ली है कि NMJs को शामिल किया गया निकालने के लिए, कक्ष से कोशिकी रिकॉर्डिंग समाधान चूसना और collagenase (बाह्य रिकॉर्डिंग समाधान में 0.4mg/ml) के बारे में 10-20 सेकंड के लिए लागू; हटाने और ताजा बाह्य रिकॉर्डिंग समाधान के साथ कई बार धोने. रिकॉर्डिंग चरण के लिए आगे बढ़ें.

सी. रिकॉर्डिंग पैच दबाना

1. एक खुर्दबीन के ऊपर - दाएँ एक 10X कृमि केंद्र उद्देश्य का उपयोग कर मंच पर रिकॉर्डिंग चैम्बर स्थिति. डीआईसी के साथ एक 40x उद्देश्य पानी प्रकट होना करने के लिए स्विच करें और जाँच करें कि शरीर की दीवार की मांसपेशियों और तंत्रिका कॉर्ड बरकरार हैं. कीड़ा स्थिति ताकि कृमि के अनुदैर्ध्य अक्ष गुंजाइश के सामने बढ़त के साथ समानांतर है, इलेक्ट्रोड दोनों बाएँ और दाएँ पक्ष से शुरू करने के लिए अनुमति है.
2. मानक पैच - तकनीक का उपयोग कर clamping मांसपेशियों पैच. के बारे में 4 megohms के प्रतिरोध की रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड अच्छी तरह से काम करते हैं. एक बार इलेक्ट्रोड मांसपेशियों झिल्ली छू लेती है, नकारात्मक दबाव में वृद्धि जब तक gigohm मुहर प्राप्त है. पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग मोड के लिए, अधिक चूषण लागू करते हैं और झिल्ली जैप तक gigohm सील उठी है. रिकॉर्डिंग में एक अच्छा शरीर जंगली प्रकार वयस्क कीड़े की दीवार की मांसपेशियों को आमतौर पर ~ 70 pF के एक सेल झिल्ली समाई है और stably न्यूनतम पकड़े धाराओं (50 ~ साथ -60 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता पर किया जा सकता है कम से कम 10 मिनट के लिए रिकॉर्ड PA).
3. NaCl 150, 5 KCl, CaCl 5 _2, MgCl ₂ 4, 10 ग्लूकोज, sucrose के 5, 15 HEPES (7.3 पीएच, ~ 330mOsm): कोशिकी रिकॉर्डिंग समाधान (मिमी में) के होते हैं. पैच विंदुक (मिमी में) शामिल हैं: 120 KCl, 20 KOH, ₂ MgCl 4, (एन tris [Hydroxymethyl] एसिड mthyl-2-aminoethane - सल्फोनिक) 5 TES dihydrate ₂ CaCl 0.25, ना ₂ 4 एटीपी, 36 sucrose EGTA 5 (7.2 पीएच, mOsm ~ 312). नोट: ये समाधान कृत्रिम क्लोराइड के साथ मांसपेशियों की कोशिकाओं लोड इतना है कि GABA रिसेप्टर मध्यस्थता धाराओं आवक -60 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता पर क्लोराइड तपका कारण हैं. इन समाधानों पर बदलाव किया गया है (विवरण के लिए प्रकाशनों देखें).
4. रिलीज पैदा की. आमतौर पर हम एक दूसरे इलेक्ट्रोड वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड समझौता मांसपेशियों के लिए पूर्वकाल पर कोशिकी समाधान युक्त जगह है. यह ढीला पैच विन्यास कम अवधि के बड़े depolarizing उत्तेजनाओं (वोल्ट के 10s के आदेश पर) (1 2ms) जंगली प्रकार के कीड़े में अधिक से अधिक पैदा की प्रतिक्रियाएं (आमतौर पर 2.0-2.5 एनए) को प्राप्त करने की आवश्यकता है. इस दृष्टिकोण की सीमाओं हैं: 1) केवल कुछ पैदा की प्रतिक्रियाओं से पहले तंत्रिका कॉर्ड अचल क्षतिग्रस्त है और 2 अज्ञात कारणों के लिए दिया जा सकता है), केवल cholinergic पैदा प्रतिक्रियाएं इस उत्तेजना विन्यास का उपयोग कर हासिल किया जा सकता है.
5. लाइट सक्रिय चैनल-rhodopsin उत्तेजना. हाल ही में, Gottschalk प्रयोगशाला ट्रांसजेनिक शैवाल व्युत्पन्न चैनल rhodopsins कि प्रकाश उत्तेजना पर न्यूरॉन्स के सबसेट में ^{झिल्ली,} बिगाड़ना 4 अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया प्रवर्तक पर निर्भर करता है. व्यक्त कीड़े उत्पन्न किया है सी. के मामले में एलिगेंस NMJ, एकीकृत या तो cholinergic मोटर न्यूरॉन्स या GABAergic मोटर न्यूरॉन्स में चैनल rhodopsin व्यक्त लाइनों अब availablई. चूंकि चैनल rhodopsin केवल प्रकाश जब सभी ट्रांस रेटिना opsin के आधा भाग के साथ जुड़ा हुआ है जवाब है, इस आवेदन के लिए इस्तेमाल किया कीड़े रेटिना से सजी बैक्टीरिया पर विकसित किया जाना चाहिए. एक हरी बत्ती पल्स तो बार बार चैनल rhodopsin सक्रिय या तो ACH या GABA के पैदा रिहाई के कारण, जिस पर ट्रांसजेनिक कीड़े का इस्तेमाल कर रहे हैं निर्भर करता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन ट्रांसजेनिक कीड़े उत्परिवर्ती उपभेदों में पार किया जा सकता है. पिछले बिजली की उत्तेजना पर इस तकनीक का लाभ शामिल हैं; 1) लाइट सक्रियण neuronal नुकसान का कारण नहीं करता अनुमति कई दोहराने stimulations प्रदर्शन किया और 2) या तो GABAergic या cholinergic मोटर न्यूरॉन्स स्वतंत्र रूप से अध्ययन किया जा सकता से रिलीज पैदा.
6. Hyperosmotic प्रेरित रिलीज. आसानी से Releasable पुटिका (सभी NMJ दर्ज की मांसपेशियों पर से primed vesicles के अभिव्यक्त पूल को दर्शाती) पूल, एक hyperosmotic कोशिकी समाधान (अतिरिक्त sucrose जोड़कर ~ 850 mOsm को समायोजित) प्रयोग किया जाता है युक्त दबाव विंदुक के आकार को मापने. 1-3 सेकंड दबाव नाड़ी अनुप्रयोगों अतुल्यकालिक बाद synaptic मानक समाधान ऊपर वर्णित का उपयोग कर की घटनाओं के एक बांध का उत्पादन.

चित्रा 1: सी. के योजनाबद्ध सिंहावलोकन एलिगेंस विच्छेदन और neuromuscular रिकॉर्डिंग विन्यास

एक sylgard लेपित smearing कांच और इलाज भर Sylgard की एक बूंद के द्वारा बनाई गई coverslip रात पूर्वनिर्मित रिकॉर्डिंग चैम्बर के परिपत्र गुहा में रखा जाता है और रिकॉर्डिंग समाधान के साथ किया गया. एक केंद्र में रखा कीड़ा Sylgard सतह से चिपके सिर या पूंछ से शुरू, कृमि के पृष्ठीय पक्ष गोंद लागू करने, एक गोंद विंदुक का उपयोग कर. एक बार gluing पूरा हो गया है, एक चीरा योनी करने के लिए आसन्न, छल्ली और गोंद के बीच इंटरफेस में एक गिलास सुई के साथ किया जाता है और सिर (लाल छेदा रेखा देख) की ओर बढ़ाया. आंत और शरीर गुहा से अंडे की निकासी के बाद, चीरा की कटौती बढ़त है हाजिर Sylgard वेंट्रल तंत्रिका (हरा) और शरीर की दीवार की मांसपेशियों (लाल) उजागर करने के लिए गोंद के साथ वेल्डेड. वेंट्रल औसत दर्जे का योनी के लिए पूर्वकाल मांसपेशियों पैच-clamped और उत्तेजक इलेक्ट्रोड अपस्ट्रीम तंत्रिका रस्सी पर रखा है.

प्रतिनिधि परिणाम

पूरे सेल, वोल्टेज clamped शरीर दीवार मांसपेशी रिकॉर्डिंग तीन उत्तेजना ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल (विद्युत पैदा की, प्रकाश पैदा की और hyperosmotic प्रतिक्रियाएं) में से प्रत्येक के लिए दिखाए जाते हैं. सभी मामलों में शरीर वेंट्रल औसत दर्जे की दीवार मांसपेशी -60 एम वी पर clamped है. ए जंगली प्रकार की मांसपेशी कोशिकाओं को आम तौर पर हमारे मानक रिकॉर्डिंग समाधान में अंतर्जात आवक लघु synaptic धाराओं की उच्च दर दिखा रहे हैं. बी पूर्वकाल उदर तंत्रिका कॉर्ड के 2ms विध्रुवण 2-2.5 आसपास NA के एक बड़े जंगली प्रकार के कीड़े में पैदा की प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप कई synapses से तुल्यकालिक रिहाई का कारण बनता है. एक बी और में जंगली प्रकार के निशान के सही प्रतिनिधि निशान एक गंभीर बेबुनियाद उत्परिवर्ती (UNC-18) में synaptic रिलीज दिखा. पैनल सी एक जंगली प्रकार कीड़ा cholinergic न्यूरॉन्स में चैनल rhodopsin व्यक्त की neuromuscular जंक्शन से प्रकाश पैदा प्रतिक्रिया दिखाता है. एक 2ms प्रकाश नाड़ी आम तौर पर 1.5-1.8 NA के एक प्रतिक्रिया पैदा करता है. डी. 1s के लिए मांसपेशियों पर 850 mOsm hyperosmotic खारा के दबाव इंजेक्शन, लघु synaptic vesicles के आसानी से Releasable पूल का प्रतिनिधित्व धाराओं के एक अतुल्यकालिक बैराज पैदा करता है.

Discussion

आनुवंशिक मॉडल जीव सी एलिगेंस, आदर्श synaptic प्रसारण के अध्ययन के लिए अनुकूल है synaptic प्रोटीन जीन एन्कोडिंग में परिवर्तन के कार्यात्मक विश्लेषण के माध्यम से. यहाँ हम एक विच्छेदन तकनीक है कि सी. renders वर्णित है एलिगेंस electrophysiological विश्लेषण के लिए सुलभ NMJs. साथ वीडियो सी. में महत्वपूर्ण कदम दर्शाया गया है एलिगेंस विच्छेदन और ठेठ रिकॉर्डिंग विन्यास synaptic गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया. 1) कीड़ा gluing कदम है, 2) एक सफल चीरा प्रदर्शन, और 3) शरीर दीवार मांसपेशियों के लिए पट्टी, तीन चरणों का है कि इस तकनीक सीखने में सबसे बड़ी चुनौतियां खड़ी हैं. एक बार इन में महारत हासिल किया गया है, इस तैयारी या तो वोल्टेज या वर्तमान दबाना दबाना मोड में पोस्ट synaptic मांसपेशियों की रिकॉर्डिंग करने के लिए उत्तरदायी है. पैदा उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाएँ आसानी से हो उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि की एक किस्म में इस dissected तैयारी का उपयोग करके मापा जा सकता है. जंगली प्रकार वयस्क कृमि (लंबाई में 1 मिमी) के पहले से ही मिनट के आकार को देखते हुए, synaptic म्यूटेंट कि वयस्कता तक पहुँच नहीं है या सूखा रहना इस विच्छेदन की दृष्टिकोण करने के लिए उत्तरदायी नहीं हो सकता. उदर तंत्रिका कॉर्ड के मोटर न्यूरॉन्स भी बहुत छोटा (सेल सोम 2-5 सुक्ष्ममापी) और electrophysiologists के लिए अतिरिक्त चुनौतियों मुद्रा, हालांकि कई प्रयोगशालाओं सफलतापूर्वक सी. से दर्ज की गई है dissected तैयारी के रूपांतरों में एलिगेंस न्यूरॉन्स यहाँ ^{5 6} वर्णित.