Разбор и запись с Junction C. Elegans нервно-мышечной

Summary

Применение электрофизиологии на доступное синапсов обеспечивает количественной мерой синаптической активности, полезной для анализа синаптических мутантов. В этой статье описывается метод вскрытия используется для предоставления нервно-мышечного соединения (NMJ) из

Abstract

Нейротрансмиссия это процесс, при котором нейроны передают информацию посредством химических сигналов для их пост-синаптических целей, на быстром масштабе времени. Это сложный процесс, требует скоординированной деятельности многих пред-и пост-синаптические белки для обеспечения надлежащего синаптические связи, проведение электрических сигналов, адресности и грунтовки секреторных везикул, кальция зондирования, слияние везикул, локализация и функции постсинаптических рецепторов и, наконец, утилизация механизмов. Как нейробиологи это наша цель, чтобы выяснить какие белки функционировать в каждом из этих этапов и понимать механизмы их действия. Электрофизиологические записи с синапсы обеспечивают количественные считываются из основных электрических событий, которые происходят во время синаптической передачи. Объединив эту технику с мощными массив молекулярных и генетических инструментов, доступных для манипулирования синаптических белков в C. Элеганс, мы можем проанализировать в результате функциональных изменений в синаптической передачи.

C. Элеганс NMJs образуется между моторных нейронов и стенкой тела мышцы контроль передвижения, таким образом, мутанты с несогласованными двигательного фенотипы (известных как UNC-ы) часто возмущают синаптической передачи на этих синапсов ^1. С UNC-мутантов ведутся на богатый запас бактериальных источник пищи, они остаются жизнеспособными, если они сохраняют некоторые глотки насосных способность глотать пищу. Это, вместе с тем, что С. Элеганс существовать как гермафродиты, позволяет им перейти на мутантных потомков без необходимости разработки поведение спаривания. Эти признаки в сочетании с нашей недавней возможностью записи от червей NMJs ^2,3,7 сделать это отличная модель организма, в котором для решения, как именно UNC-мутантов воздействием нервных импульсов.

Рассечение метод включает иммобилизации взрослых червей использующих cyanoacrylic клеем, чтобы сделать разрез на червя кутикулы подвергая NMJs. С С. Элеганс взрослых только 1 мм в длину вскрытие производится с использованием микроскопа и рассекает требует отличную координацию рук и глаз. NMJ записи сделаны цельноклеточная напряжения зажима отдельных стенки тела мышечные клетки и нейромедиатор релиз может быть вызвано использованием различных протоколов, включая стимуляцию электрической стимуляции, светло-активированного канала родопсин-опосредованной деполяризации ⁴ и гиперосмотического солевой раствор, все из которых будут Кратко описаны.

Protocol

А. Подготовка инструментов, используемых для вскрытия.

1. Рассечение / записи камеры: Как правило, мы построим нашу запись камеры из 1 / ¹⁶ дюйм магнитного листа, с круглым отверстием в центре, что является достаточно большим, чтобы разместить 22 мм диаметр кругового стеклянной крышкой. Внешние размеры камеры будет зависеть от столике микроскопа делали записи. На обратной стороне магнитного листа, мы придаем 48 х 60 мм покровным стеклом, которой мы придерживаемся в камеру, поместив шарик низкой расплава Paraplax ткани вложение воск в каждом углу покровным стеклом зажат между стеклом и камеры . Воск затем таял на горячей плите, стеклянную пластинку вверх, пока она не образует сплошной слой склеивания покровным стеклом для камеры. Не оставляйте этот шаг без присмотра воск тает быстро. Камера должна быть удалена и охлаждается, как только воск расплавится. Избыточный воск, который просочился по внутреннему краю 22 мм круговой полости можно удалить с помощью край лезвия бритвы.
2. Sylgard покрытием скользит обложки: вскрытие производится на 22 мм, Sylgard покрытием покровным стеклом, который находится в круге, обрамленном полости записи камеры. Пальто Sylgard помогает cyanoacrylic клея придерживаться покровным стеклом при наклеивании червей вниз, а также выступает в качестве подушки, на которых сломать спину клей пипетки, когда она станет подключен. Sylgard состоит из свежих соответствии с инструкциями производств (10 частей силиконовые основы к 1 части отвердителя по весу). Маленькая капля Sylgard затем помещается на каждом покровным стеклом и смазывают через использование край лезвия бритвы, чтобы сделать ровную поверхность. Покрытие крышки скользит помещаются в большой плоской закрытые контейнеры и оставляют в 65 ° градусов духовке ночь, чтобы вылечить.
3. Пипетки: Как правило, мы используем те же 1 мм, внешний диаметр нити боросиликатного стекла для создания пипетки для склеивания червей вниз, что делает кутикулы разрезы и записи от мышц, с помощью электродов съемника. Желательно, чтобы вытащить банку с пипетки, прежде чем пытаться рассечение, как этот этап может потребовать нескольких быстрого обмена пипеток.
4. Клей аппликатора: Клей загружается и применяется с кончика пипетки клей, внутрь давления. Склеивания пипетки вставляется в один конец 2 фута кусок полиэтиленовой трубы с внутренним диаметром, который соответствует наружному диаметру стеклянной пипетки (обычно 1 мм). Другой конец трубки держит кончиком пипетки Eppendorf, который действует как рот кусок.
5. Добыча пипетки: червь внутренних органов должны быть удалены из червей полость раз кутикулы разрез был сделан. Это достигается с куском трубы придает кончиком пипетки Eppendorf похож на клей, аппликатор, но в данном случае стеклянной пипетки добычи нарушается назад достаточно, чтобы яйца и внутренности, чтобы быть легко пылесосить из червя полости.

Б. рассечение

1. В записи камеры кольцевой линии пера воск обращается близко к периметру камеры которому Sylgard покрытием крышки скольжения крепко на месте (Sylgard пальто вверх). Этот воск линии обездвиживает покровным стеклом и предотвращает запись решение не просачивается под и выбивании покровным стеклом во время вскрытия и записи. Затем камера заполнена внеклеточной решение для записи и несколько червей помещают в центр, используя червь выбор. Черви будут плавать в растворе, однако с практикой, эти черви могут быть склеены вниз без каких-либо процедур, таких как охлаждение, чтобы предотвратить движение. В ходе тренинга этапе, это может помочь практике склеивания мутант червей, в котором плавание нарушается (например, UNC-31 мутанты).
2. Клей контейнера сделана из крышки ПЦР проведен в воска или пластилина, используется для хранения рабочего запаса cyanoacrylic клея. Клей пипетки с аналогичными размерами кончика пипетки записи (обычно ~ 4 МОм сопротивления) используются для применения клея. Использование клея аппликатор, небольшое количество клея засасывается в пипетку клей, с помощью вскрытия возможности для визуализации пипетки, как клей засасывается.
3. Cyanoacrylic клей (HistoacrylBlue, Aesulap) полимеризуется при контакте с внеклеточной решение для записи, поэтому важно сохранить положительное давление на клей пипетки, поскольку это входит камера решение, чтобы избежать клея из закалки и подключить пипетки. Как только пипетки клей в камере решение, небольшой, но постоянный поток клей необходимо наносить на поверхность Sylgard в рот контроля давления, чтобы предотвратить подключение. Если пипетка становится подключен иногда это может быть разблокирован, мягко нажав на кончике sylgard-стекла с покрытием. Рекомендуется, чтобы вы придерживаетесь склеивания перед тем, как клеить червей. Если вы можете регулярно вписать свое имя в клей на Sylgard, с письмами из линий тоньше, чем ширина червей вы готовы процессыEED для склеивания червь кутикулы.
4. Чтобы клей червя, использование положительного давления приложить небольшое количество клея либо голову или хвост червя и быстро нарисовать червь вниз на поверхность Sylgard. Попробуйте приложить червь недалеко от центра камеры, как черви клееного слишком близко к краю будет трудно достичь с записью пипеток. Затем нанесите постоянный поток клея вдоль верхнего края кутикулы червя от начальной привязанности, заставляя червя в С-позиции вульвы перед внутрь (для записи вентральных мышц). Любые пробелы в этой клеевой шов должен быть заполнен так, что червь сильно привязан, чтобы предотвратить червя во время отсоединения кутикулы шаг разрез.
5. Для того, чтобы кутикулы разрез, переключиться на ручной рассечение пипетки. Это пипетки должны быть острее, чем клей / записи пипетки и короткие, крепкие вала. Использование самых увеличение на вскрытии рамки, выравнивание пипетки параллельно продольной оси червяка и вставить отзыв о середине вдоль червя (близко к вульвы), что делает разрез на кутикулу / клей интерфейс. Этот разрез релизы давление червей гидростатического заставляя яйца и кишечника через разрез точки. Продолжить резки кутикулу в сторону головы червя с нарезки движения похожи на открытии письма, пока не дойдете до глотки. Переключитесь на добычу пипетки в вакуум из внутренних органов червя. После очистки разрез, открыл кутикулы будет хранить его в цилиндрическую форму. Используйте свежие пипетки приклеивания к точечной сварки вырезать края кутикулы вниз на поверхность Sylgard. Важно использовать минимальное пятна клея на данном этапе, чтобы избежать повреждения или затемняя NMJs.
   Вентральной мускулатуры нервов мозга и стенки тела подвергаются сейчас.
6. Для удаления базальной мембраны, которая покрывает NMJs, отсасывать внеклеточной решение для записи с камеры и применить коллагеназы (0.4mg/ml во внеклеточной решение для записи) в течение 10-20 секунд, снять и мыть несколько раз со свежим внеклеточной решение для записи. Приступить к записи сцены.

С. Патч-зажим записи

1. Установите камеру на записи до правого столике микроскопа использованием 10X цель центра червя. Переключить на 40Х воды всплытии цель с ДВС и убедитесь, что стенки тела мышц и нервов мозга без изменений. Позиция червя так, чтобы продольная ось червь параллельно с переднего края рамки, что позволяет электроды должны быть введены как из левой и правой сторон.
2. Патч мышц с использованием стандартных патч-зажимной техники. Запись электродов около 4 МОм Сопротивление хорошо работать. Как только электрод касается мышц мембраны, повышение отрицательного давления до уплотнения gigohm получается. Для цельноклеточная напряжения зажим режиме записи, применять более всасывания и столкновение мембраны до уплотнения gigohm разрывается. В хорошую запись, стенки тела мышцы дикого типа червей взрослых обычно имеют клеточной мембраны емкость ~ 70 пФ и может быть стабильно записанные в течение 10 минут при проведении потенциал -60 мВ с минимальными проведения токов (~ 50 рА).
3. Внеклеточной решение для записи состоит из (в мМ): NaCl 150, KCl 5, CaCl ₂ 5, MgCl ₂ 4, глюкоза 10, сахароза 5, HEPES 15 (рН 7,3, ~ 330mOsm). Патч пипетки содержит (в мМ): KCl 120, КОН 20, MgCl ₂ 4, (N-трис [Гидроксиметил] mthyl-2-аминоэтан-сульфокислоты) TES 5, дигидрат CaCl ₂ 0,25, Na ₂ АТФ 4, сахароза 36 , EGTA 5 (рН 7,2, ~ 312 мОсм). Примечание: Эти решения искусственно нагрузки мышечные клетки с хлоридом, так что ГАМК рецептор-опосредованного токов внутрь из-за истечения хлорида на проведение потенциал -60 мВ. Вариации на эти решения были использованы (см. публикации право).
4. Вызванные релизе. Обычно мы размещаем второй электрод содержащие внеклеточного раствора на передней брюшной нервной цепочки для исправления мышцы. Это свободные конфигурации патч требует больших деполяризующего раздражители (порядка 10 секунд вольт) непродолжительны (1-2мс) для достижения максимальной вызвали ответы (обычно 2.0-2.5 нА) в дикого типа червей. Ограничения этого подхода являются: 1) Только несколько вызвало ответные меры могут быть поставлены перед нерв шнур необратимо повреждены и 2) По неизвестным причинам, только холинергических вызвало ответные меры могут быть выявлены с помощью этой стимуляции конфигурации.
5. Свет активированного канала родопсина стимуляции. В последнее время лаборатория Готтшальк породила трансгенных червей выражения водорослей полученных канал rhodopsins что деполяризации мембраны при световой стимуляции в подмножества нейронов, в зависимости от промоутера используется для привода выражения ^4. В случае с C. Элеганс NMJ, интегрированные линии, экспрессирующие канал родопсина в любом холинергических нейронов двигателя или ГАМК-моторные нейроны теперь available. Поскольку канал родопсина реагирует только на свет, когда все-транс сетчатки связана с опсина фрагмент, черви используются для этой заявке должны быть выращены на бактерии с добавкой сетчатки. Зеленый световой импульс может быть использован повторно активировать канал родопсина вызывая вызвал выпуск либо АЧ или ГАМК, в зависимости от трансгенных черви используются. Эти трансгенные червей можно пересечь в мутантных штаммов. Преимущество этого метода по сравнению с предыдущим электрической стимуляции включают в себя: 1) Светло-активация не приводит к повреждению нейронов, что позволяет многим стимуляции повторить должны быть выполнены и 2) освобождение от вызванных либо ГАМКергических или холинергических нейронов двигателя может быть самостоятельно изучены.
6. Гиперосмотического высвобождение. Для измерения размеров легко-разборных пузырьков бассейн (отражающие подведены пул загрунтовать пузырьки из всех NMJ-дисков записаны мышцы), давление пипетки содержащие гиперосмотического внеклеточного раствора (доводят до ~ 850 мОсм путем добавления дополнительных сахароза) не используется. Давление импульса применения 1-3 секунд производят шквал асинхронных постсинаптических событий с использованием стандартных решений, описанных выше.

Рисунок 1: Схема обзор C. Элеганс вскрытие и нервно-мышечной конфигурацией записи

Sylgard покрытием покровное сделанные размытия капли Sylgard по стеклу и лечения ночь помещается в круговой полости камеры сборные записи и покрыты записи решения. Червь находится в центре приклеен к поверхности Sylgard начиная с головы или хвоста, применяя клей на спинной стороне червя, используя клей пипетки. После склеивания завершена, разрез, прилегающих к вульвы, на границе между кутикулой и клея производится с иглой стекло и расширенные к голове (см. красной перфорированной линии). После извлечения внутренних органов и яйца из полости тела, вырезать края разреза точечной сварки с клеем Sylgard подвергая вентрального нерва (зеленый) и мышцах стенки тела (красный). Вентральной-медиальной мышцы впереди вульвы патч-зажаты и стимулирующий электрод помещается вверх по течению на нерв мозга.

Представитель результаты

Всего-клеток, напряжения тела зажаты записи стене мышц показаны для каждого из трех протоколов стимуляции, описанных выше (электрически вызвали, светло-и вызвала гиперосмотического ответов). Во всех случаях вентральный-медиальной стенки тела мышцы зажимается при -60 мВ. А. дикого типа мышечные клетки обычно имеют высокий уровень эндогенных внутрь миниатюрной синаптической токов в наши стандартные решения записи. Б. 2 мс деполяризации передней брюшной нервной причин синхронных освобождения из нескольких синапсов в результате чего большая вызвало реакцию по всему 2-2,5 нА в дикого типа червей. Представитель следы справа от дикого типа следов в А и В показывают синаптических релиз, в сильно несогласованных мутант (UNC-18). Группа C показывает световых вызвало реакцию со стороны нервно-мышечного соединения диким типом червя выражения канал родопсина в холинергических нейронах. 2 мс световой импульс обычно производит реакцию 1.5-1.8 нА. Д. давления выброса 850 мОсм гиперосмотического солевой на мышцы в течение 1 с, производит асинхронные шквал миниатюрной синаптической токов представляющая легко-разборных пул везикул.

Discussion

Генетическая модель организма C, Элеганс идеально подходит для изучения синаптической передачи, через функциональный анализ мутаций в генах, кодирующих синаптических белков. Здесь мы описали рассечение техника, которая делает C. Элеганс NMJs доступными для электрофизиологического анализа. Сопровождающее видео изображены критические шаги в C. Элеганс вскрытие и типичная конфигурация записи, используемые для измерения синаптической активности. Три шага, которые создают больших проблем в процессе обучения этой техники являются: 1) шаг червь склейка, 2) выполнение успешного разрез, и 3) исправление на мышцах стенки тела. Как только эти были освоены, этот препарат поддается записи постсинаптических мышцы в любом напряжении зажим или ток-зажим режимах. Ответы на раздражители вызывали можно легко измерить с помощью этого расчлененного подготовки в различных мутантных фонов. С учетом уже минуту размер дикого типа взрослого червя (1 мм в длину), синаптической мутантов, которые не достигают взрослой жизни или оставаться тощей, возможно, не поддаются этой рассечение подход. Двигательные нейроны брюшной нервной также очень небольшой (2-5 мкм ячейка сома), и создают дополнительные проблемы для электрофизиологов, хотя несколько лабораторий успешно записан с C. Элеганс нейронов в вариациях расчлененный подготовки описаны здесь ^{5 6.}