Summary
بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. جزء 1 من 3.
Abstract
الأسرة
Protocol
الجزء 1 : إعداد العدوى
- تنمو خلايا هيلا في قوارير وانتظر حتى الخلايا ما يقرب من 80 ٪ متموجة.
- يعد يكفي الفيروسية متوسطة النمو للتجربة : DMEM منتظمة مع FBS 2 ٪ وليس المضادات الحيوية المضافة.
- لا يمكن أن يؤديها للعدوى مع الأسهم إما الخام من فيروس الوقس مع عيار المعروفة ، أو السكروز النقي مع الفيروس المعروف عيار إذا كنت قلقا بشأن التعبير الجيني المضيف.
- إذا كنت تستخدم الفيروسات السكروز النقي ، انتقل مباشرة إلى الجزء 2.
- إذا كنت تستخدم فيروس الوقس الخام المخزون ، قبل العدوى ، an قسامة يصوتن للفيروس في sonicator الكأس مع حمام من الثلج في معظمها ، والقليل من الماء.
- يصوتن في حوالي 30W لمدة 20 ثانية.
- دوامة أنبوب وكرر صوتنة 3 مرات ، إضافة المزيد من الجليد عند الحاجة للحفاظ على الكأس مملوءة الجليد ومبردة.
- في دوامة بين كل خطوة صوتنة.
- انتقل إلى الجزء 2.
- بدلا من ذلك ، إذا كنت لا تملك sonicator الكأس ، مزيج حجم مساو للمخزون الخام وفيروس التربسين 0.25mg/mL.
- دوامة بقوة.
- احتضان الفيروس الأسهم / التربسين المزيج في بالحمام المائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- الدوامة على فترات 5-10 دقائق.
- انتقل إلى الجزء 2.
الجزء 2 : اصابة الخلايا
- حساب كمية من الجسيمات الفيروسية اللازمة لتصيب المونولاير على تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية). عادة ، يتم استخدام أعلى مستوى وزارة الداخلية (بين 5 و 10) لtimecourses العدوى.
- إضافة المبلغ المطلوب من فيروس السكروز النقي أو فيروس trypsinized الخام إلى 37 درجة مئوية وسائط النمو الفيروسي وتخلط جيدا. يجب استخدام وسائل الإعلام بما يكفي لتغطية الجزء السفلي فقط من القارورة. على سبيل المثال ، 10 مل من وسائل الاعلام عن قارورة T - 175.
- إزالة وسائل الاعلام من الخلايا وشطف مع درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني.
- إضافة للفيروس / وسائط النمو الفيروسي إلى كل القارورة.
- دوامة بلطف ، لوحات مغطاة واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5 ٪ لمدة 1 ساعة.
- الإمالة ودوامة لوحات كل 15 دقيقة لانتشار الفيروس بشكل موحد والحفاظ على الخلايا رطبة.
- لنقطة 0hr/Mock الوقت ، إضافة سائط النمو الفيروسي فقط ، مع عدم وجود الفيروس المضافة.
- بعد حضانة 1 ساعة ، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس ، وشطف ثلاث مرات مع درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني.
- إضافة أكبر قدر ممكن من النمو الفيروسي المتوسطة إلى كل القارورة. على سبيل المثال ، 30 مل من وسائل الاعلام عن قارورة T - 175. بدء العد ل ك 0 نقطة زمنية ساعة.
الجزء 3 : حصاد الخلايا
- فحص الخلايا تحت المجهر ونلاحظ أي تأثير الاعتلال الخلوي (CPE).
- إزالة وسائل الإعلام وشطف الخلايا مع 30 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني.
- إضافة 15 مل من التربسين إلى الخلايا واحتضان ل5min - 2 في 37 درجة مئوية.
- الاختيار تحت المجهر لخلايا المفرزة والاستفادة من القارورة بلطف لإزاحة الخلايا.
- نقل الخلايا مع ماصة معقمة a المصلية في أنبوب مخروطي 50 مل.
- غسل القارورة مع حجم مساو من وسائل الاعلام نمو الخلايا ، وإضافة وسائل الإعلام إلى الخلايا trypsinized في أنبوب مخروطي الشكل.
- أجهزة الطرد المركزي في الخلايا ز × 300 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة التربسين / وسائل الإعلام من بيليه الخلية.
- Resuspend الكرية خلية في أي كاشف TRIzol العازلة أو تحلل من العزلة التي تريدها مجموعة الحمض النووي الريبي.
- إذا كنت تستخدم TRIzol ، تقسيم العينة إلى 1 aliquots مل في 1.5mL أنابيب إيبندورف وصفت والتجميد في -80 درجة مئوية.
- أكرر للجميع النقاط الزمنية ، والحصاد one القارورة في نقطة زمنية.
الجزء 4 : استخراج عينات الحمض النووي الريبي في TRIzol
- عند هذه النقطة ، ينبغي معلق في العينات الخاصة بك كاشف TRIzol وعلى استعداد لمعالجتها.
- إضافة 200μL للفصل BCP المرحلة الكاشف لكل مليلتر 1 من TRIzol في كل أنبوب. قد تحتاج لنقل عينة لأكبر أنبوب إذا كنت تبدأ مع كمية كبيرة من TRIzol.
- دوامة أو تهزه بقوة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
- العينة في جهاز الطرد المركزي 12000 XG لمدة 15 دقيقة.
- نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد. المرحلة المائية هي طبقة واضحة بشأن القمة. يجب أن تكون استعادة 600μL تقريبا لكل من 1mL TRIzol كنت بدأت مع.
- القيام استخراج second الفينول / كلوروفورم ، وهذه المرة باستخدام 500μL من كلوروفورم في TRIzol 1 مل ، بدلا من BCP.
- دوامة أو تهزه بقوة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
- العينة في جهاز الطرد المركزي 12000 XG لمدة 15 دقيقة.
- نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد. المرحلة المائية هي طبقة واضحة بشأن القمة.
- إضافة 20μg من الأكريلاميد خطية إلى كل عينة. والأكريلاميد خطية بمثابة الناقل ويساعد على ترسيب الحمض النووي الريبي.
- إضافة 500 & ميCRO ؛ لتر من الأيزوبروبانول في 1 مل من TRIzol كنت بدأت مع كل عينة وتخلط جيدا.
- احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في microcentrifuge في أقصى سرعة لمدة 10-15 دقيقة.
- سيكون بيليه RNA تكون مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب. بعناية فائقة ، وإزالة طاف من الأنبوب ، إما مع الشافطة فراغ ، أو يدويا بواسطة pipettor. لا تخل بيليه.
- غسل بيليه مع 1 مل من الايثانول 70 ٪.
- إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 70 ٪ لبيليه.
- الطرد المركزي في سرعة قصوى 14000 ز لمدة 5-7 دقائق.
- بعناية فائقة ، وإزالة الإيثانول من الأنبوب ، إما مع الشافطة فراغ ، أو يدويا بواسطة pipettor. تأكد من أن بيليه مرئيا في الجزء السفلي من الأنبوب.
- تجاهل طاف.
- كرر الخطوة يغسل. بعد تجاهل طاف ، حيث بيليه هو علامة على الأنبوب.
- بيليه الهواء الجاف لمدة لا تزيد مدة 5 دقائق. لا overdry ، أو RNA سيكون من الصعب إعادة!
- إذا كنت ترغب في متابعة العلاج الدناز اختياري لإزالة أي الحمض النووي المتبقي من العينة ، وresuspend بيليه في 17μL nuclease خالية من المياه. خلاف ذلك ، وresuspend بيليه في 20μL nuclease خالية من المياه والاستمرار في الخطوة 22.
- (اختياري الدناز العلاج) عن طريق مجموعة Qiagen الدناز ريبونوكلياز خالية ، إضافة 2μL RDD العازلة وإعادة 1μL ريبونوكلياز خالية الدناز الأول لهذا الحمض النووي الريبي معلق. المزيج بلطف.
- (اختياري الدناز العلاج) احتضان عند 37 درجة مئوية ل30 دقيقة.
- (اختياري الدناز العلاج) إضافة 2μL من EDTA 2.5 ملم واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإبطال نشاط الدناز. لا تتجاوز درجة الحرارة أو تعطيل الوقت وأوقات أطول / ارتفاع درجات الحرارة يمكن أن يسبب تدهور الحمض النووي الريبي.
- فحص الحمض النووي الريبي التي تركز معمل.
- تخزين عينة الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
- (QC الاختياري) للتحقق من الجودة باستخدام الحمض النووي الريبي BioAnalyzer اجيلنت ، أو عن طريق تشغيل العينة على تغيير طبيعة جل والتحقق من قراءات OD. (260nm ونسبة 260/280)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة
الجزء 1 & 2
هناك العديد من الخطوات الحاسمة لوضع عدوى الوقس متزامن ، الأول صوتنة حذرا يجري (أو trypzinizing) من الفيروس ، من أجل تفصيل جزيئات الفيروس. الوقس معرضة بشكل كبير للتجميع ، والتعطيل من جسيمات الفيروس أمرا هاما لضمان العدوى حتى من الخلايا. من أجل تحقيق العدوى المتزامنة ، ينبغي استخدام وزارة الداخلية العالية (أكبر من 2) للتأكد من إصابة كل خلية. وهناك خليط من الخلايا المصابة وغير المصابة يؤدي إلى جولات متعددة من العدوى ، ومخاليط متجانسة من النقاط الزمنية ، والاستجابات غير متزامنة الترانسكربتي الفيروسية والمضيف. ينبغي أن تتم العدوى في كميات ضئيلة من وسائل الإعلام للسماح الحد الأقصى لامتصاص الفيروس في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، هز العادية للقوارير أو أطباق الثقافة (كل 10 دقائق) تمكن الفيروس عبر توزيع القارورة ، ويضمن أن الخلايا لا تجف.
الجزء 4
يستخدم 1 - برومو - 3 - chloropropane (BCP) بدلا من الفينول للحد من التلوث الجيني DNA. وتلى ذلك العلاج الدناز اختياري ويمكن أيضا (Qiagen RNAase الحرة الدناز) أن يؤديها من أجل القضاء على أي الحمض النووي الجيني المتبقية. ويستخدم الكلوروفورم استخراج الثاني لإزالة أي آثار للمذيب عضوي من استخراج ، والمبالغ حتى تتبع الخطوات يمكن أن تكبح التضخيم لاحقة. ويمكن الكشف عن آثار BCP الفينول / اثر ارتفاع في 270nm (خارج الذروة القياسية في 260nm) عند قياس الامتصاصية من الحمض النووي الريبي مجموع بعد الاستخراج. إذا كان يبدو مثل هذا التلوث ، وإعادة استخراج الحمض النووي الريبي (RNA الاستخراج باستخدام فلتر أو عمود القائم على أسلوب) قبل الانتقال إلى التضخيم. المبلغ الأدنى اللازم من الحمض النووي الريبي لتنفيذ رد فعل التضخيم هو 100ng ، ولكن يفضل 500 1000ng.
التطبيق / أهمية
يمكن تهجين الحمض النووي الريبي المسمى الناتجة عن هذا البروتوكول لميكروأرس البشرية والفيروسية ، أو مخصصة لتقييم الاستجابات التعبير الجيني للخلايا المصابة في الثقافة. منصات ميكروأري تختلف ، لذلك اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد خليط من التهجين المسبار المسمى.
باستخدام مجموعة مخصصة الفيروسة الجدرية مصممة 1 ، تمكنا من جينات وراثية في تصنيف فئات عامة من "المبكر" أو "المتأخرة" استنادا إلى توقيت إشارة التهجين وعما إذا كانت أو لم تكن مطلوبة تكرار الحمض النووي الفيروسي للكشف عن نص. لاحظنا في الفئات الوظيفية المتوقعة من الجينات في كل فئة الزمنية (أي في وقت مبكر من المتوقع الجينات والمتوسطة والمتأخرة) والاختلاف في التوقيت الدقيق لالنسخ.
الأساليب المستخدمة في هذا العمل هي قادرة على التنبؤ جينات فيروس كتب في وقت مبكر أو في وقت متأخر من دورة النسخ المتماثل ، ولكن لديها أكثر صعوبة في التمييز المبكر فقط مقابل الجينات مع المروج المبكرة والمتأخرة منذ النصوص مع المروج المبكر / أواخر المزدوج قد تستمر وتكون الكشف في أوقات متأخرة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تعمل من خلال النسخ من الجينات الفيروسية أواخر تؤثر في إشارة التحقيق معين / بقعة على طائفة ، لأن التهجين الحمض النووي الريبي إلى الصفيف قد تأتي من ORF ORF المعينة أو المنبع. صفائف تبليط حاولت حل هذه المشكلة ، ولكن التحديات لا تزال قائمة في كشف من خلال تشغيل النسخ التهجين باستخدام نهج يستند 2،3،4.
ويمكن أيضا أنماط الترانسكربتي المضيف يتم تقييمها باستخدام هذه الأساليب. ومع ذلك ، الوقس بترميز مجموعة متنوعة من الآليات لكبح ردود المضيفة ، وربما يكون تناقص ردود المضيف الترانسكربتي مقارنة مع غيرها من المحفزات 5،6،7،8. منذ يتم تبديل التعبير عن العديد من الجينات تشارك في الدفاع المضيف بعد الإصابة ، ينبغي بالتالي مساهمة الجينات الفيروسية التي مواجهة الاستجابات المناعية للمضيف أن تؤخذ بعين الاعتبار.
باستخدام هذه الأساليب ، ويمكن التعرف على خريطة توقيت الترانسكربتي جميع الجينات الفيروسية وتستخدم لاستجواب وظائف الجينات الفيروسية مجهولة. بالإضافة ، يمكن أن تستخدم هذه الأساليب لتشريح الحوار المعقدة بين الفيروس والمضيف. هذه الأساليب قابلة للتطبيق على نطاق واسع لأنظمة أخرى العدوى المضيف الممرض. إذا لا فائدة من الممرض ومذيل بعديد الأدينيلات mRNAs ، يمكن استخدام أساليب بديلة لتسمية مباشرة على الحمض النووي الريبي مجموع ، دون تضخيم الخطية. من خلال تحليل كل من المضيف وفيروس التعبير الجيني خلال العدوى المتزامنة ، وهذه الأساليب تسمح لنا لاكتساب نظرة ثاقبة فيروس التفاعل مع البيئة المضيف الخلوية وكذلك استضافة دفاعات مضادة ضد عدوى الفيروس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
معهد وايتهيد زملاء صناديق
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work. |
| BCP Phase Separation Reagent | Reagent | Molecular Research Center | BP151 | |
| RNase-Free DNase Set | Reagent | Qiagen | 79254 | DNase treatment is an optional step. |
References
- KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
