Summary
चेचक संक्रमण और कोशिकाओं मेजबान और वायरल जीन की अभिव्यक्ति के HeLa के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल. 3 के भाग 1.
Abstract
परिवार
Protocol
भाग 1: संक्रमण की स्थापना
- बोतल में HELA कोशिकाओं बढ़ो और इंतजार जब तक कोशिकाओं मिला हुआ लगभग 80% हैं.
- 2% FBS के साथ नियमित रूप से DMEM और नहीं जोड़ा एंटीबायोटिक दवाओं: प्रयोग के लिए पर्याप्त वायरल मध्यम विकास तैयार.
- संक्रमण या तो एक ज्ञात टिटर के साथ चेचक वायरस के कच्चे शेयर, या एक ज्ञात टिटर के साथ वायरस शुद्ध sucrose अगर आप मेजबान जीन की अभिव्यक्ति के बारे में चिंतित हैं के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है है.
- यदि आप sucrose शुद्ध वायरस का उपयोग कर रहे हैं, भाग 2 के लिए सीधे आगे बढ़ना.
- यदि आप एक कच्चे चेचक वायरस स्टॉक का उपयोग कर रहे हैं, बस संक्रमण के लिए पहले, एक कप sonicator में ज्यादातर बर्फ की एक स्नान और एक छोटे से पानी के साथ वायरस के एक विभाज्य sonicate.
- 20 सेकंड के लिए 30W के आसपास Sonicate.
- ट्यूब भंवर और sonication 3 बार दोहराना, और अधिक बर्फ जोड़ने अगर बर्फ और ठंडा के साथ पैक कप रखने की जरूरत है.
- प्रत्येक sonication कदम के बीच में भंवर.
- भाग 2 के लिए आगे बढ़ें.
- वैकल्पिक रूप से, अगर आप एक कप sonicator पास नहीं है, कच्चे वायरस शेयर और 0.25mg/mL trypsin के एक बराबर मात्रा में मिश्रण.
- सख्ती भंवर.
- 30 मिनट के लिए वायरस / शेयर trypsin एक 37 डिग्री सेल्सियस waterbath में मिश्रण सेते हैं.
- 5-10 मिनट के अंतराल पर भंवर.
- भाग 2 के लिए आगे बढ़ें.
भाग 2: संक्रमित कोशिकाओं
- वायरल संक्रमण के वांछित बहुलता (MOI) पर monolayer संक्रमित करने की जरूरत कणों की राशि की गणना. आमतौर पर, एक MOI उच्च (5 और 10 के बीच) संक्रमण timecourses के लिए प्रयोग किया जाता है.
- 37 sucrose शुद्ध वायरस या trypsinized कच्चे वायरस के वांछित राशि जोड़ें डिग्री सेल्सियस वायरल विकास मीडिया और मिश्रण अच्छी तरह से. आप पर्याप्त मीडिया का उपयोग करने के लिए बस के नीचे फ्लास्क को कवर किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, एक T-175 फ्लास्क के लिए मीडिया के 10 एमएल.
- कोशिकाओं से मीडिया निकालें और कमरे के तापमान पीबीएस से कुल्ला.
- प्रत्येक फ्लास्क वायरस / वायरल विकास मीडिया जोड़ें.
- धीरे भंवर, झुकाव प्लेटें और 37 पर सेते ° 1 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सी.
- घुमाएँ और ज़ुल्फ़ प्लेटें हर 15 मिनट में वायरस का प्रसार करने के लिए समान और कोशिकाओं को नम रखने के.
- एक 0hr/Mock समय बिंदु के लिए, केवल वायरल विकास मीडिया के साथ कोई वायरस जोड़ा, जोड़.
- 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, मीडिया वायरस युक्त निकालने के लिए, और कमरे के तापमान पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला.
- प्रत्येक फ्लास्क वायरल मध्यम विकास की अधिकतम राशि जोड़ें. उदाहरण के लिए, एक T-175 फ्लास्क के लिए मीडिया के 30 एमएल. अपने 0 घंटा समय बिंदु के रूप में इस गिनती शुरू करो.
भाग 3: फसल काटने वाले कोशिकाओं
- एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें और किसी भी cytopathic प्रभाव (CPE) ध्यान दें.
- मीडिया निकालें और कमरे के तापमान पीबीएस के 30 एमएल के साथ कोशिकाओं कुल्ला.
- कोशिकाओं को trypsin के 15 एमएल जोड़ें और 37 पर 2-5min सेते डिग्री सेल्सियस
- सेल टुकड़ी के लिए खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें और कुप्पी धीरे नल के लिए कोशिकाओं को हटाना.
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ कोशिकाओं का स्थानांतरण.
- सेल के विकास मीडिया के एक बराबर मात्रा के साथ फ्लास्क धो, और शंक्वाकार ट्यूब में trypsinized कोशिकाओं को मीडिया जोड़ने.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x जी कोशिकाओं अपकेंद्रित्र .
- Trypsin / सेल गोली से मीडिया निकालें.
- या तो TRIzol अभिकर्मक या अपने वांछित आरएनए अलगाव किट से lysis बफर में सेल गोली Resuspend.
- यदि आप TRIzol का उपयोग कर रहे हैं, 1.5mL लेबल Eppendorf ट्यूबों और फ्रीज में 1 एमएल aliquots में -80 पर नमूना विभाजित डिग्री सेल्सियस
- सभी समय अंक के लिए दोहराएँ, समय बिंदु प्रति एक फ्लास्क कटाई.
भाग 4: नमूनों की TRIzol में शाही सेना निकासी
- इस बिंदु पर, अपने नमूनों TRIzol अभिकर्मक में resuspended किया जाना चाहिए और संसाधित किया जा के लिए तैयार है.
- BCP चरण पृथक्करण अभिकर्मक प्रत्येक ट्यूब में हर 1 TRIzol के एमएल के लिए 200μL जोड़ें. तुम अगर तुम बाहर TRIzol की एक बड़ी राशि के साथ शुरू कर रहे हैं एक बड़ा ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण की आवश्यकता हो सकती है.
- भंवर या सख्ती शेक और 2-3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र.
- एक ताजा ट्यूब जलीय चरण स्थानांतरण. जलीय चरण के शीर्ष पर स्पष्ट परत है. आप TRIzol आप के साथ बाहर शुरू की हर 1ml के लिए लगभग 600μL ठीक किया जाना चाहिए.
- दूसरा phenol / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण, BCP के बजाय इस समय का उपयोग क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर TRIzol प्रति 500μL, करो.
- भंवर या सख्ती शेक और 2-3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र.
- एक ताजा ट्यूब जलीय चरण स्थानांतरण. जलीय चरण के शीर्ष पर स्पष्ट परत है.
- प्रत्येक नमूना के लिए रेखीय acrylamide का 20μg जोड़ें. रैखिक acrylamide एक कैरियर के रूप में कार्य करता है और शाही सेना वेग में मदद करता है.
- जोड़ें 500 और मीलCRO, isopropanol के एल TRIzol के 1 मिलीलीटर प्रति आप के साथ बाहर शुरू प्रत्येक नमूने के लिए और मिश्रण अच्छी तरह से.
- 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं.
- 10-15 मिनट के लिए अधिकतम गति पर एक microcentrifuge में अपकेंद्रित्र.
- आरएनए गोली ट्यूब के तल पर दिखाई देगा. बहुत सावधानी से ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, या तो एक वैक्यूम Aspirator के साथ, या मैन्युअल रूप से pipettor द्वारा. गोली परेशान मत करो.
- 1 70% इथेनॉल एमएल के साथ गोली धो लें.
- गोली के लिए 70% इथेनॉल 1 एमएल जोड़ें.
- शीर्ष गति से 5-7 मिनट के लिए 14,000 ग्राम अपकेंद्रित्र.
- बहुत सावधानी से ट्यूब से इथेनॉल निकालने के लिए, या तो एक वैक्यूम Aspirator के साथ, या मैन्युअल रूप से pipettor द्वारा. जाँच करें कि गोली ट्यूब के तल पर दिखाई देता है.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- धोने कदम दोहराएँ. सतह पर तैरनेवाला के बाद खारिज कर दिया है, निशान जहां गोली ट्यूब पर है.
- एयर सूखी गोली के लिए 5 मिनट से अधिक लंबी नहीं है. Overdry मत करो, या शाही सेना को पुनर्गठित करने के लिए मुश्किल हो जाएगा!
- यदि आप वैकल्पिक DNase उपचार का पालन करने के लिए नमूना से किसी भी शेष डीएनए निकालने की इच्छा, nuclease मुफ्त पानी के 17μL में गोली resuspend. अन्यथा, nuclease मुफ्त पानी के 20μL में गोली resuspend और जारी रखने के लिए 22 कदम.
- (वैकल्पिक DNase उपचार) Qiagen RNase मुक्त DNase सेट का उपयोग जोड़ने के लिए, 2μL बफर RDD और 1μL RNase मुक्त मैं DNase resuspended शाही सेना के लिए पुनर्गठित. धीरे मिश्रण.
- (वैकल्पिक DNase उपचार) 37 पर सेते ° C 30 मिनट के लिए.
- (वैकल्पिक DNase उपचार) 65 से कम 2.5 मिमी EDTA और सेते 2μL जोड़ें ° सी के 5 मिनट के लिए DNase निष्क्रिय करने के लिए. निष्क्रियता समय या तापमान से अधिक है के रूप में अब बार / उच्च तापमान शाही सेना की गिरावट पैदा कर सकता है मत करो.
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा शाही सेना एकाग्रता की जाँच करें.
- -80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना नमूना स्टोर
- (वैकल्पिक QC) शाही सेना का उपयोग कर एक Agilent BioAnalyzer गुणवत्ता की जाँच करें, या एक denaturing जेल पर नमूना चल रहा है और आयुध डिपो रीडिंग की जाँच के द्वारा. (260nm और 260/280 अनुपात)
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Discussion
गंभीर कदम
पार्ट 1 और 2
वहाँ एक तुल्यकालिक चेचक संक्रमण की स्थापना के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं, पहली बार जा रहा वायरस से सावधान sonication (या trypzinizing), क्रम में वायरस कणों disaggregate. चेचक उच्च कुल के लिए खतरा है, और वायरस कणों का विघटन कोशिकाओं के भी संक्रमण को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. आदेश में एक तुल्यकालिक संक्रमण प्राप्त करने के लिए, एक MOI उच्च (2 से अधिक) सुनिश्चित करने के प्रत्येक कोशिका को संक्रमित है के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. संक्रमित और uninfected कोशिकाओं का एक मिश्रण के संक्रमण के कई दौर, समय अंकों की विषम मिश्रण, और अतुल्यकालिक वायरल और मेजबान transcriptional प्रतिक्रियाओं के लिए नेतृत्व करेंगे. संक्रमण मीडिया के कम से कम मात्रा में बाहर किया जाना चाहिए कोशिकाओं पर वायरस के अधिकतम सोखना की अनुमति. इसके अलावा, बोतल या संस्कृति व्यंजन (हर 10 मिनट) के नियमित रूप से मिलाते वायरस की कुप्पी भर में वितरण के लिए सक्षम बनाता है और यह सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं को बाहर सूखी नहीं.
भाग 4
1-Bromo-3-chloropropane (BCP) phenol के स्थान पर प्रयोग किया जाता है जीनोमिक डीएनए संदूषण कम. एक बाद में वैकल्पिक DNase उपचार (Qiagen मुक्त DNase RNAase) के लिए किसी भी शेष जीनोमिक डीएनए को खत्म करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है. एक दूसरा क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण निष्कर्षण से कार्बनिक विलायक के किसी भी अंश को निकालने के लिए, के रूप में भी मात्रा का पता लगाने के बाद प्रवर्धन कदम को बाधित कर सकते हैं प्रयोग किया जाता है. / Phenol BCP के निशान 270nm पर एक कील (260nm पर मानक शिखर से परे) के रूप में पता लगाया जा सकता है जब निष्कर्षण के बाद कुल शाही सेना के absorbance मापने. यदि ऐसे संदूषण दिखाई देता है, प्रवर्धन के लिए आगे बढ़ने से पहले शाही सेना (एक फिल्टर या स्तंभ आधारित शाही सेना निष्कर्षण विधि का प्रयोग करके) फिर से निकालने के. शाही सेना की न्यूनतम राशि के लिए प्रदर्शन की जरूरत है एक प्रवर्धन प्रतिक्रिया 100ng है, तथापि, 500 1000ng पसंद है.
/ आवेदन महत्व
लेबल इस प्रोटोकॉल से परिणामस्वरूप आरएनए मानव, वायरल, या कस्टम प्रोटीन संकरित संस्कृति में संक्रमित कोशिकाओं के जीन की अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं का आकलन किया जा सकता है. माइक्रोएरे प्लेटफार्मों भिन्न है, तो लेबल जांच से संकरण मिश्रण की तैयारी के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
एक कस्टम डिजाइन poxvirus एक सरणी का उपयोग करना, हम सामान्य श्रेणियों में "जल्दी" या "देर" संकरण संकेत के समय पर आधारित है और चाहे या नहीं वायरल डीएनए प्रतिकृति प्रतिलेख पता लगाने के लिए आवश्यक किया गया था जीन वर्गीकृत कर रहे थे. हम प्रत्येक अस्थायी कक्षा में जीन की उम्मीद कार्यात्मक श्रेणियों (यानी, जल्दी, मध्यवर्ती और देर जीन की उम्मीद) प्रतिलेखन के सही समय के रूप में परिवर्तन मनाया.
इस काम में उपयोग तरीकों वायरस प्रतिकृति चक्र में जल्दी या देर लिखित जीन की भविष्यवाणी करने में सक्षम हैं, लेकिन एक जल्दी और देर प्रमोटर के साथ एक दोहरी / जल्दी देर प्रमोटर के साथ टेप के बाद जीन बनाम अधिक कठिनाई भेद केवल प्रारंभिक जारी रहती है और हो सकता है देर से समय पर पाया. इसके अलावा, देर वायरल जीनों के ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से चलाने के एक दिया / सरणी पर जांच मौके पर संकेत को प्रभावित है, सरणी के लिए hybridizing शाही सेना के रूप में नामित ओआरएफ या एक अपस्ट्रीम ओआरएफ से आया हो सकता है है हो सकता है. खपरैल का छत arrays के लिए इस समस्या को हल करने का प्रयास किया है, लेकिन चुनौतियों संकरण आधारित 2,3,4 दृष्टिकोण का उपयोग प्रतिलेखन के माध्यम से चलाने के पता लगाने में रहते हैं.
होस्ट transcriptional पैटर्न भी इन तरीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. हालांकि, चेचक तंत्र की एक किस्म encodes के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं रोकना, और मेजबान transcriptional प्रतिक्रियाओं अन्य 5,6,7,8 stimuli करने के लिए तुलना में कम हो सकता है . कई मेजबान बचाव में शामिल जीनों की अभिव्यक्ति के बाद संक्रमण के बाद बदल दिया है, इसलिए वायरल जीन है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया के योगदान को ध्यान में लिया जाना चाहिए.
इन तरीकों का उपयोग, सभी वायरल जीनों के transcriptional समय का एक नक्शा और पहचान किया जा सकता है अज्ञात वायरल जीनों के कार्यों को पूछताछ के लिए इस्तेमाल किया. इसके अलावा, इन तरीकों वायरस और मेजबान के बीच जटिल वार्ता टुकड़े करना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. इन विधियों अन्य मेजबान रोगज़नक़ संक्रमण सिस्टम को मोटे तौर पर लागू होते हैं. यदि ब्याज की रोगज़नक़ mRNAs polyadenylated नहीं करता है, वैकल्पिक तरीकों को सीधे कुल शाही सेना लेबल किया जा सकता है रैखिक प्रवर्धन के बिना. दोनों मेजबान और तुल्यकालिक संक्रमण के दौरान वायरस जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके, इन तरीकों हमें मेजबान सेलुलर के रूप में अच्छी तरह के रूप में वायरस के संक्रमण के खिलाफ मेजबान वातावरण काउंटर गढ़ के साथ वायरस बातचीत में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए अनुमति देते हैं.
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Acknowledgments
व्हाइटहेड संस्थान अध्येता फंड
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work. |
| BCP Phase Separation Reagent | Reagent | Molecular Research Center | BP151 | |
| RNase-Free DNase Set | Reagent | Qiagen | 79254 | DNase treatment is an optional step. |
References
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