Summary
HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。 3のパート1。
Abstract
家族の
Protocol
パート1：感染症のセットアップ
- フラスコにHeLa細胞を成長し、細胞が約80％コンフルエントになるまで待ちます。
- 2％FBSとの定期的なDMEMと添加しない抗生物質：実験のために十分なウイルスの増殖培地を準備します。
- 感染症は、どちら原油既知の力価を持つワクシニアウイルスの株式、またはあなたがホストの遺伝子の発現が心配な場合は、既知の力価でウイルスを精製白糖を行うことができます。
- あなたがウイルスを精製白糖を使用している場合は、パート2に直接進みます。
- あなただけの感染前に、原油ワクシニアウイルス株を使用している場合は、主に氷のお風呂と少量の水でカップの超音波処理でウイルスのアリコートを超音波で分解する。
- 20秒のために30W前後で超音波処理。
- ボルテックスチューブと氷とチルドを充填したカップを保つために、必要に応じてより多くの氷を追加し、超音波処理を3回繰り返す。
- 各超音波処理のステップの間に渦。
- パート2に進んでください。
- また、あなたがカップの超音波処理を有していない場合、原油ウイルスストックと0.25mg/mLのトリプシンの等量を混合する。
- 激しくボルテックスする。
- 30分間37℃ウォーターバスでのウイルスストック/トリプシンミックスをインキュベートする。
- 5〜10分間隔で渦。
- パート2に進んでください。
パート2：細胞に感染
- 感染の目的の多重度（MOI）で単層に感染するために必要なウイルス粒子の量を計算します。一般的に、MOI（5〜10）高は、感染のtimecoursesに使用されます。
- 37ウイルスまたはトリプシン処理原油のウイルスを精製白糖、所望量の° Cのウイルス増殖培地を加え、よく混ぜる。あなただけのフラスコの底部をカバーするのに十分なメディアを使用する必要があります。たとえば、T - 175フラスコのためのメディアを10mL。
- 細胞から培地を取り除き、室温のPBSですすいでください。
- 各フラスコにウイルス/ウイルス増殖のメディアを追加します。
- 優しくスワール、37℃傾斜プレートをインキュベート℃で1時間5％CO2インキュベーターでC。
- チルトと渦のプレートは15分ごとに一様にウイルスを拡散し、細胞の潤いを保つために。
- 0hr/Mockの時点では、唯一のウイルスの増殖培地を追加し、ないウイルスには、追加された。
- 1時間のインキュベーションの後、ウイルスを含むメディアを削除し、そして室温PBSで3回リンス。
- 各フラスコにウイルスの増殖培地の最大量を追加。たとえば、T - 175フラスコのためのメディアの30 mLの。あなたの0時間の時点としてこれをカウントを開始。
パート3：収穫の細胞
- 顕微鏡下で細胞を確認し、すべての細胞変性効果（CPE）を注意してください。
- メディアを取り出し、室温PBS 30 mLで細胞をリンス。
- 細胞にトリプシンの15 mLを加え、37℃で2 - 5分間インキュベート℃に
- 細胞の剥離を顕微鏡で確認し、細胞を取り除くために、静かにフラスコをタップします。
- 50 mLコニカルチューブに滅菌血清ピペットで細胞を移す。
- 細胞増殖培地の等量でフラスコを洗い、円錐管にトリプシン処理細胞にメディアを追加。
- 室温で5分間、300 × gで細胞を遠心分離します。
- 細胞ペレットからトリプシン/メディアを取り出します。
- ご希望のRNA単離キットからTRIzol試薬または溶解バッファーのいずれかで細胞ペレットを再懸濁します。
- あなたがTRIZOLを使用している場合は、-80℃で1.5mlのラベルが付いたエッペンドルフチューブや凍結の1mLのアリコートにサンプルを分割℃に
- タイムポイントごとに1つのフラスコを収穫する、すべての時間ポイントについて繰り返します。
パート4：TRIZOLのサンプルのRNA抽出
- この時点で、あなたのサンプルを処理できる状態にTRIzol試薬中に再懸濁させ、されるべきである。
- 各チューブのTRIZOLのすべての1 mLのためのBCPの相分離試薬の200μLを追加。あなたがTRIZOL大量の話から始めている場合、より大きなチューブにサンプルを転送する必要がある場合があります。
- ボルテックスや激しい振とうし、2〜3分間室温でインキュベートする。
- 15分間12,000 xgでサンプルを遠心分離します。
- 新しいチューブに水相を移す。水相は、上に透明層である。あなたがから始めたTRIZOLのすべての1mLのための約600μL回復されるべきである。
- 代わりに、BCPの第二のフェノール/クロロホルム抽出、1mlのトリゾールあたりのクロロホルム500μLを使用して、この時間を、ください。
- ボルテックスや激しい振とうし、2〜3分間室温でインキュベートする。
- 15分間12,000 xgでサンプルを遠心分離します。
- 新しいチューブに水相を移す。水相は、上に透明層である。
- 各サンプルに線形アクリルアミドの20μgを追加。リニアアクリルアミドは、キャリアとして機能し、RNAを沈殿させるために役立ちます。
- 500＆マイルを追加CRO、TRIZOL 1mlあたりイソプロパノールのLは、それぞれのサンプルにしてスタートし、よく混ぜる。
- 室温で10分間サンプルをインキュベートする。
- 10〜15分、最高速度で遠心機で遠心する。
- RNAペレットは、チューブの下部に表示されます。非常に慎重に、どちらかの真空吸引器で、または手動ピペッターで、チューブから上清を取り除く。ペレットを乱さないでください。
- 70％エタノール1mLでペレットを洗浄します。
- ペレットに70％エタノール1mLを追加。
- トップスピードで5-7分、14,000 gで遠心します。
- 非常に慎重に、真空吸引器のいずれかで、チューブからエタノールを削除する、または手動ピペッターで。その際、ペレットがチューブの下部に表示されていることを確認してください。
- 上清を捨てる。
- 洗浄ステップを繰り返します。上清を廃棄した後に、ペレットがチューブ上のどこにマークします。
- 5分よりもはや自然乾燥ペレット。乾燥し過ぎたしない、またはRNAを再構成することが難しくなるためです！
- あなたがサンプルから、残りのDNAを除去するために、オプションのDNase処理をフォローしたい場合は、ヌクレアーゼフリー水17μLでペレットを再懸濁します。そうでない場合は、ヌクレアーゼフリー水20μLでペレットを再懸濁し、22に進みます。
- （オプションのDNase処理）キアゲンのRNaseフリーのDNaseセットを使用して、2μlのバッファRDDと1μLで再懸濁したRNAにRNaseフリーのDNase Iを再構成に追加します。穏やかに混合する。
- （オプションのDNase処理）37℃で30分間。
- （オプションのDNase処理）65で2.5 mMのEDTAとインキュベートの2μlの追加℃で5分間は、DNaseを失活させる。長い時間/より高い温度ではRNAの分解を引き起こすことができるように不活性化の時間や温度を超えないようにしてください。
- 分光光度計によるRNA濃度を確認してください。
- -80℃でのRNAサンプルを保存する
- （オプションQC）アジレントバイオアナライザを用いてRNAの品質をチェック、または変性ゲルでサンプルを実行し、OD測定値をチェックして。 （260nmのと280分の260比）
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Discussion
重要なステップ
パート1＆2
ウイルス粒子を分解するために、同期ワクシニア感染症、ウイルスの最初のもの慎重に超音波処理を（またはtrypzinizing）、セットアップするには、いくつかの重要なステップがあります。ワクシニアウイルスは、集約の影響を受けやすい国である、とウイルス粒子の破壊は細胞のさらに感染を確保するために重要です。同期感染を達成するために、MOI（2より大きい）高は、各セルが感染していることを確認するために使用する必要があります。感染および非感染細胞の混合物は、感染の複数回、時間の点の異種混合物、および非同期のウイルスと宿主の転写反応につながる。感染は、細胞にウイルスの最大吸着できるように、メディアの最小限の量で実施されるべきである。加えて、フラスコや培養皿（10分ごと）の定期的な揺れは、フラスコでウィルスの配布を可能にし、細胞が乾燥しないことが保証されます。
パート4
1 - ブロモ-3 - クロロプロパン（BCP）は、ゲノムDNAの混入を減らすために、フェノールの代わりに使用されます。それに続くオプションのDNase処理（キアゲンリボヌクレアーゼフリー- DNアーゼ）も、残りのゲノムDNAを除去するために実施することができる。であっても微量では、その後の増幅のステップを阻害することができるように、第2クロロホルム抽出は、抽出から有機溶媒の痕跡を削除するために使用されます。フェノール/ BCPの痕跡は、抽出後にトータルRNAの吸光度を測定するとき（260nmで標準ピークを超えて）270nmでのスパイクとして検出することができます。そのような汚染が表示された場合は、増幅に進む前にRNAを（フィルタまたは列ベースのRNA抽出法を用いて）再抽出する。増幅反応を実行するために必要なRNAの最小量は100ngですが、500 1000ngが好ましい。
アプリケーション/意義
このプロトコルに起因する標識されたRNAは、培養で感染した細胞に遺伝子発現の応答を評価するために、人間のウイルス、またはカスタムマイクロアレイにハイブリダイズすることができます。マイクロアレイプラットフォームが異なるため、標識プローブからハイブリダイゼーション混合物の調製のための製造業者の指示に従ってください。
カスタム設計されたポックスウイルスの配列1を使用して 、我々は、ウイルスDNAの複製は、転写産物の検出に必要なされたかどうかを"早期"か"遅い"のハイブリダイゼーションシグナルのタイミングに基づいての一般的なカテゴリに遺伝子を分類することができた。我々は、転写の正確なタイミングに、各時間のクラスでの遺伝子の予想される機能カテゴリ（すなわち、初期の中間と後期遺伝子を期待される）の変動を観察した。
この作業で利用されるメソッドは、早期または複製サイクルの後半で転写、ウイルスの遺伝子を予測することはできますが、デュアル初期/後期プロモーターと転写産物が解消されないとなる可能性があるため初期および後期プロモーターによる遺伝子対の早期のみ区別する多くの困難を持っている遅い時間に検出された。配列にハイブリダイズするRNAは、指定されたORFまたは上流のORFから来ている可能性があるのでさらに、後期ウイルス遺伝子の転写を介して実行には、アレイ上の特定のプローブ/スポットで信号に影響を及ぼす可能性があります。タイル配列はこの問題を解決しようとした、しかし課題は、ハイブリダイゼーションベースの手法2,3,4を用いて転写を介して実行検出に残ります。
ホスト転写パターンも、これらの方法を用いて評価することができる。しかし、ワクシニア、ホストの応答を抑制するためのさまざまなメカニズムをエンコードし、宿主の転写反応は、他の刺激5,6,7,8に比べて短くなる可能性があります。宿主防御に関与する多くの遺伝子の発現は感染後に変更されているため、宿主の免疫応答を打ち消すのウイルス遺伝子の寄与は、したがって、考慮する必要があります。
これらのメソッドを利用して、すべてのウイルス遺伝子の転写タイミングのマップが同定され、未知のウイルス遺伝子の機能を調べるために使用することができます。さらに、これらの方法は、ウイルスと宿主との間の複雑な対話を分析するために利用することができます。これらのメソッドは、他の宿主 - 病原体の感染システムに広く適用可能である。興味のある病原体は、ポリアデニル化mRNAを持っていない場合は、代替法は線形増幅することなく、直接トータルRNAを標識するために使用することができます。同期感染時の両方のホストとウイルスの遺伝子発現を解析することによって、これらのメソッドは、私たちはウイルス感染に対する宿主細胞環境だけでなく、ホストカウンター防御とウイルスの相互作用を把握することができます。
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Acknowledgments
ホワイトヘッド研究所フェローファンド
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work. |
| BCP Phase Separation Reagent | Reagent | Molecular Research Center | BP151 | |
| RNase-Free DNase Set | Reagent | Qiagen | 79254 | DNase treatment is an optional step. |
References
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