Summary
Protokoll för vaccinia infektion av HeLa celler och analys av värd och virus genuttryck. Del 1 av 3.
Abstract
Familjen
Protocol
Del 1: Upprättande av infektionen
- Väx HeLa celler i flaskor och vänta tills cellerna är ca 80% konfluenta.
- Förbered tillräckligt virala grogrund för experimentet: regelbunden DMEM med 2% FBS och utan tillsats av antibiotika.
- Infektionen kan utföras med antingen en grov lager av vaccinia virus med känd titer, eller sackaros renat virus med känd titer om du är bekymrad över värd genuttryck.
- Om du använder sackaros renade virus, gå direkt till del 2.
- Om du använder en rå vaccinia virus lager, strax före infektionen, låt ligga en alikvot av viruset i en kopp sonicator med ett bad av mestadels is och lite vatten.
- Sonikera runt 30W i 20 sekunder.
- Vortex röret och upprepa sonication 3 gånger, lägga till mer is om det behövs för att hålla koppen fylld med is och kylt.
- Vortex i mellan varje sonication steg.
- Gå vidare till del 2.
- Alternativt, om du inte har en kopp sonicator, blanda en lika stor volym av den råa viruset lager och 0.25mg/mL trypsin.
- Vortex kraftigt.
- Inkubera viruset lager / trypsin blanda i en 37 ° C vattenbad under 30 minuter.
- Vortex på 5-10 minuters intervall.
- Gå vidare till del 2.
Del 2: infektera celler
- Beräkna mängden viruspartiklar behövs för att infektera cellslager på önskad mångfald av infektion (MOI). Normalt är ett högt MOI (mellan 5 och 10) används för infektion timecourses.
- Tillsätt önskad mängd sackaros renade virus eller trypsinized råolja viruset till 37 ° C virus tillväxt medier och blanda väl. Du bör använda tillräckligt media för att bara täcka botten av kolven. Till exempel 10 ml av media för en T-175-kolv.
- Ta bort materialet från cellerna och skölj med rumstemperatur PBS.
- Lägg till virus / virala medier tillväxt till varje kolv.
- Snurra försiktigt, luta plattorna och inkuberas vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator i 1 timme.
- Tilt och snurra tallrikar var 15 minuter för att sprida virus jämnt och hålla celler fuktig.
- För en 0hr/Mock tidpunkt, lägg den virala tillväxten media enbart, utan virus till.
- Efter 1 timme inkubation, ta bort materialet som innehåller virus, och skölj tre gånger med rumstemperatur PBS.
- Lägg till det högsta beloppet av viral tillväxt medium till varje kolv. Till exempel 30 ml av media för en T-175-kolv. Börjar räkna detta som din 0 HR tidpunkt.
Del 3: Skörd celler
- Kontrollera att cellerna i mikroskop och notera eventuella cytopatisk effekt (CPE).
- Ta bort materialet och spola cellerna med 30 ml rumstemperatur PBS.
- Tillsätt 15 ml trypsin till cellerna och inkubera i 2-5min vid 37 ° C.
- Kolla under mikroskop för cell lossnar och knacka kolven försiktigt för att få bort celler.
- Överför celler med en steril serologisk pipett i en 50 ml koniska rör.
- Skölj kolven med en lika stor volym av media celltillväxt, och lägga till media till trypsinized celler i koniska röret.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter i rumstemperatur.
- Ta bort trypsin / media från cellpelleten.
- Resuspendera cellpelleten i antingen TRIzol reagens eller lyseringsbuffert från din önskade RNA isolering kit.
- Om du använder TRIzol, dela upp provet i 1 mL alikvoter i 1,5 mL märkta Eppendorf-rör och frys vid -80 ° C.
- Upprepa för alla tidpunkter, skörd en kolv per tidpunkt.
Del 4: RNA-extraktion av prover i TRIzol
- I det här läget bör din proverna resuspenderas i TRIzol reagens och redo att bearbetas.
- Tillsätt 200μL för BCP fasseparation Reagens för varje 1 mL TRIzol i varje rör. Du kan behöva överföra provet till en större tub om du börjat med en stor mängd TRIzol.
- Vortex eller skaka kraftigt och inkubera vid rumstemperatur i 2-3 minuter.
- Centrifugera provet vid 12.000 xgi 15 minuter.
- Överför vattenfasen till ett nytt rör. Vattenfasen är den tydliga lager på toppen. Du bör återhämta ungefär 600μL för varje 1 mL TRIzol du började med.
- Gör en andra fenol / kloroform utvinning, denna gång med 500μL kloroform per 1 ml TRIzol, i stället för BCP.
- Vortex eller skaka kraftigt och inkubera vid rumstemperatur i 2-3 minuter.
- Centrifugera provet vid 12.000 xgi 15 minuter.
- Överför vattenfasen till ett nytt rör. Vattenfasen är den tydliga lager på toppen.
- Lägg 20μg av linjära akrylamid till varje prov. Den linjära akrylamid fungerar som bärare och hjälper till att fälla ut RNA.
- Tillsätt 500 & MiCRO, L isopropanol per 1 ml TRIzol du började med att varje prov och blanda väl.
- Inkubera prov i rumstemperatur i 10 minuter.
- Centrifugera i mikrocentrifug med maximal hastighet i 10-15 minuter.
- RNA-pellets kommer att synas längst ner i röret. Mycket försiktigt, avlägsna supernatanten från röret, antingen med ett vakuum aspirator eller manuellt genom pipett. Stör inte pelleten.
- Tvätta pelleten med 1 ml 70% etanol.
- Tillsätt 1 ml 70% etanol till pellets.
- Centrifugera vid toppfart 14.000 g 5-7 minuter.
- Mycket noggrant, avlägsna etanolen från röret, antingen med ett vakuum aspirator eller manuellt genom pipett. Kontrollera att pellets är synlig längst ner i röret.
- Kassera supernatanten.
- Upprepa tvättningen. Efter supernatanten kasseras, markera var pellet på röret.
- Lufttorka pellets längre än 5 minuter. Låt inte strykfria eller RNA kommer att vara svårt att rekonstruera!
- Om du vill följa den frivilliga DNas behandling för att avlägsna eventuell kvarvarande DNA från provet, Återsuspendera pelleten i 17μL av nukleasfritt vatten. Annars Återsuspendera pelleten i 20μL av nukleasfritt vatten och fortsätt till steg 22.
- (Valfritt DNas behandling) med hjälp av Qiagen RNase-fria DNas set, lägga 2μL buffert FUD och 1μL rekonstituerade RNase-fria DNas jag till återsuspenderade RNA. Blanda försiktigt.
- (Valfritt DNas behandling) Inkubera vid 37 ° C i 30 minuter.
- (Valfritt DNas behandling) Lägg 2μL av 2,5 mM EDTA och inkubera vid 65 ° C i 5 minuter för att inaktivera DNas. Överskrid inte inaktivering tid eller temperatur längre tid / högre temperaturer kan orsaka nedbrytning av RNA.
- Kontrollera RNA-koncentrationen av spektrofotometer.
- Förvara RNA provet vid -80 ° C.
- (Valfritt QC) Kontrollera RNA kvalitet med hjälp av en Agilent BioAnalyzer, eller genom att köra provet på en denaturering gel och kontroll av OD-avläsningar. (260nm och 260/280 ratio)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
Del 1 & 2
Det finns flera viktiga steg för att upprätta en synkron vaccinia infektion, den första är försiktig ultraljudsbehandling (eller trypzinizing) av viruset, för att dela upp viruspartiklar. Vaccinia är mycket benägen att sammanställa, och avbrott i viruspartiklar är viktigt för att ens infektion av celler. För att uppnå en synkron infektion bör ett högt MOI (större än 2) användas för att säkerställa varje cell är infekterad. En blandning av infekterade och oinfekterade celler kommer att leda till flera omgångar av infektion, heterogena blandningar av tidpunkter, och asynkrona virus och värd transkriptionell svar. Infektionen bör utföras i minimala mängder av media för att ge maximal adsorption av virus till cellerna. Dessutom möjliggör regelbunden skakning av kolvar eller maträtter kultur (varje 10 minuter) spridning av virus över kolven och ser till att cellerna inte torka ut.
Del 4
1-Bromo-3-klorpropan (BCP) används i stället för fenol att minska arvsmassans DNA-kontamination. En senare tillval DNAse behandling kan (Qiagen RNAase Free-DNAse) också göras för att undanröja kvarstående arvsmassans DNA. En andra kloroform extraktion används för att avlägsna alla spår av organiskt lösningsmedel vid utvinning, eftersom även spårmängder kan hämma efterföljande förstärkning steg. Spår av fenol / BCP kan identifieras som en spik vid 270nm (utöver den vanliga topp på 260nm) vid mätning av absorbans totala RNA efter extraktion. Om en sådan förorening visas packa RNA (med ett filter eller en kolumn-baserat RNA-extraktion metod) innan du fortsätter med förstärkning. Minsta mängd RNA behövs för att utföra en amplifieringsreaktionen är 100 ng, men det är 500-1000ng föredra.
Ansökan / Betydelse
Den märkta RNA till följd av detta protokoll kan hybridiseras till mänskliga, virus eller anpassade microarrays att bedöma svaren genuttryck för att infekterade celler i kultur. Microarray plattformar varierar, så följ tillverkarens anvisningar för beredning av hybridisering blandning från märkta sonden.
Med hjälp av en specialgjord poxvirus rad 1, kunde vi klassificera gener i den allmänna kategorier av "tidiga" eller "sen" bygger på tidpunkterna för hybridisering signal och huruvida viralt DNA replikation krävdes för avskrift upptäckt. Vi observerade den förväntade funktionella kategorier av gener i varje temporala klass (dvs. förväntad tidig, mellan-och sena gener) variation den exakta tidpunkten för transkription.
De metoder som används i detta arbete kan förutse viruset gener transkriberas tidigt eller sent i replikering cykel, men har svårare att skilja tidiga bara kontra gener med en tidig och sen promotor sedan avskrifter med en dubbel tidigt / sent promotor kan kvarstå och vara upptäcktes vid sena tider. Dessutom kan genomgång transkription av sena virala gener påverkar signal vid en viss sond / fläck på arrayen, vilket RNA hybridisering att arrayen kan ha kommit från den utsedda ORF eller en uppströms ORF. Plattsättning arrayer har försökt att lösa detta problem, men utmaningar återstår att upptäcka köra genom transkription med hybridisering strategier 2,3,4.
Värd transkriptionell mönster kan också bedömas med hjälp av dessa metoder. Men kodar vaccinia en mängd mekanismer för att hämma värd svar, och värd transkriptionell svar kan bli lägre jämfört med andra stimuli 5,6,7,8. Eftersom uttrycket av många gener inblandade i värd försvar förändras efter infektion, bör bidraget av virala gener som motverkar värd immunsvaret därför beaktas.
Med hjälp av dessa metoder kan en karta över transkriptionell timing av alla virala gener kan identifieras och användas för att förhöra funktioner okända virala gener. Dessutom kan dessa metoder användas för att dissekera den intrikata dialogen mellan virus och värd. Dessa metoder är i stort sett tillämpas på andra värd-patogen infektion system. Om den patogen av intresse inte har polyadenylated mRNA, kan alternativa metoder användas för att direkt märka totala RNA, utan linjär förstärkning. Genom att analysera både värd och virus genuttryck under synkron infektion, dessa metoder ger oss möjlighet att få inblick i virus interaktion med värden cellulära miljön liksom värd counter-försvar mot virusangrepp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Fonder
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work. |
| BCP Phase Separation Reagent | Reagent | Molecular Research Center | BP151 | |
| RNase-Free DNase Set | Reagent | Qiagen | 79254 | DNase treatment is an optional step. |
References
- KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
