Summary
Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.
Abstract
Aile
Protocol
Bölüm 1: enfeksiyon ayarlama
- Matara HeLa hücreleri büyümek ve hücrelerin yaklaşık% 80 konfluent kadar bekleyin.
- % 2 FBS ile düzenli DMEM ve ilavesiz antibiyotikler: deney için yeterli viral büyüme ortamı hazırlayın.
- Enfeksiyon ya ham vaccinia virüs bilinen bir titreye sahip hisse senedi, ya da ev sahibi gen ekspresyonu ile ilgili endişeleriniz varsa, bilinen bir titreye sahip virüs saflaştırılmış sakaroz ile yapılabilir.
- Doğrudan devam, sakaroz saflaştırılmış virüs kullanıyorsanız, bölüm 2.
- Hemen önce enfeksiyonu, ham vaccinia virüs stok kullanıyorsanız, çoğunlukla buz banyosu ve bir miktar su ile bir bardak sonikatör virüsün bir kısım sonikasyon.
- 30W yaklaşık 20 saniye boyunca sonikasyon.
- Vorteks tüp ve buz ve soğuk dolu bardağı tutmak için gerekirse daha fazla buz ekleyerek, sonication 3 kez tekrarlayın.
- Her sonication adım arasında vorteksleyin.
- Bölüm 2 ile devam edin.
- Alternatif olarak, bir fincan sonikatör sahip değilse, ham virüs stok ve 0.25mg/mL tripsin eşit miktarda karıştırın.
- Şiddetle Vortex.
- 37 ° C su banyosunda 30 dakika süreyle virüs stok / tripsin karışımı inkübe.
- 5-10 dakika aralıklarla Vortex.
- Bölüm 2 ile devam edin.
Bölüm 2: Enfekte hücrelerin
- , Enfeksiyon istenen çokluğu (İçişleri Bakanlığı) tek tabaka bulaştırmak için gerekli viral parçacıkların miktarını hesaplayın. Tipik olarak, (5 ila 10) İçişleri Bakanlığı, yüksek enfeksiyon timecourses için kullanılır.
- 37 sakaroz saflaştırılmış virüs veya tripsinize ham virüs istenilen miktarda ° C viral büyüme medya ve iyice karıştırın. Sadece balonun alt kapağı için yeterli medyayı kullanmak gerekir. Örneğin, medya bir T-175 şişesinde 10 ml.
- Hücrelerden medyayı çıkartın ve oda sıcaklığında PBS ile durulayın.
- Her balona virüs / viral büyüme ortamı ekleyin.
- Nazikçe Swirl, 37 ° eğim plakaları ve inkübe ° C 1 saat süreyle% 5 CO2 inkübatör.
- Tilt ve girdap levhalar her 15 dakikada düzgün virüs yaymak ve hücrelerinin nemli tutmak için.
- Bir 0hr/Mock zaman noktası için, hiçbir virüs, sadece viral büyüme medya ekleyebilirsiniz.
- 1 saat inkübasyondan sonra, virüsü içeren medyayı çıkartın ve oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın.
- Her balona viral büyüme ortamının maksimum miktarda ekleyin. Örneğin, medya bir T-175 şişesinde 30 ml. 0 saat zaman noktası olarak sayma başlayın.
Bölüm 3: Hasat hücreleri
- Hücrelerin mikroskop altında kontrol edin ve herhangi bir sitopatik etki (CPE) not edin.
- Medyayı çıkartın ve oda sıcaklığında PBS 30 ml ile durulayın hücreleri.
- Tripsin 15 mL hücrelere ekleyin ve 37 2-5dk inkübe ° C.
- Hücre ayrılması için mikroskop altında kontrol edin ve hücreleri çıkarmak için şişeyi hafifçe dokunun.
- Hücreleri, steril bir serolojik pipet yardımıyla 50 ml konik bir tüp içine aktarın.
- Hücre büyümesi medya eşit hacmi ile şişesi yıkayın ve konik tüp tripsinize hücreleri için ortam ekleyin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g hücreleri santrifüjleyin.
- Hücre pelet tripsin / medya çıkarın.
- İstediğiniz RNA izolasyon kiti TRIzol reaktif veya lizis tamponu ya da hücre pelletini tekrar.
- TRIzol kullanıyorsanız, -80 1.5mL etiketli Eppendorf tüpleri ve dondurma 1 ml alikotları örnek bölmek ° C
- Zaman noktası başına bir şişeyi hasat, tüm zamanların noktaları için tekrarlayın.
Bölüm 4: TRIzol numune RNA ekstraksiyonu
- Bu noktada, örnekleri işlenecek hazır TRIzol reaktif yeniden bekletildi ve olmalıdır.
- Her bir tüp içinde TRIzol her 1 mL BCP Faz Ayırma Reaktif 200μL ekleyin. TRIzol büyük bir miktarı ile başlıyor, daha büyük bir tüp örnek aktarmak gerekebilir.
- Vortex veya kuvvetlice çalkalanır ve oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin.
- 15 dakika boyunca 12.000 xg'de örnek santrifüjleyin.
- Sulu faz temiz bir tüpe aktarın. Sulu faz açık üst katmanı. Ile başlayan TRIzol her 1 ml için yaklaşık 600μL kurtarmak olmalıdır.
- BCP yerine ikinci bir fenol / kloroform ekstraksiyon, 1 ml TRIzol başına kloroform 500μL kullanarak bu kez yapın.
- Vortex veya kuvvetlice çalkalanır ve oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin.
- 15 dakika boyunca 12.000 xg'de örnek santrifüjleyin.
- Sulu faz temiz bir tüpe aktarın. Sulu faz açık üst katmanı.
- Her bir örnek için doğrusal akrilamid 20μg ekleyin. Doğrusal akrilamid bir taşıyıcı gibi davranır ve RNA'yı çöktürmek için yardımcı olur.
- Ekle 500 & micro; izopropanol L TRIzol 1 ml başına her bir örnek ile başladı ve iyice karıştırın.
- 10 dakika boyunca oda sıcaklığında numune inkübe edin.
- 10-15 dakika maksimum hızda bir mikrosantrifüj santrifüjleyin.
- RNA pelet tüpün alt kısmında görünür olacaktır. Çok dikkatli bir şekilde, bir vakum aspiratör ile, ya tüpten süpernatantı kaldırmak veya elle pipet. Pelet rahatsız etmeyin.
- Pelet 1 ml% 70 etanol ile yıkayın.
- Pelet için 1 ml% 70 etanol ekleyin.
- En yüksek hızda 5-7 dakika boyunca 14.000 g santrifüjleyin.
- Çok dikkatli bir şekilde, bir vakum aspiratör ile, ya etanol tüpten kaldırmak veya elle pipet. Pelet tüpün alt kısmında görünür olduğunu kontrol edin.
- Süpernatantı atın.
- Yıkama adımı yineleyin. Süpernatantı atılır sonra pelet tüp işaretleyin.
- 5 dakikadan daha uzun süre Hava kuru pelet. Overdry, yoksa RNA sulandırmak için zor olacak!
- Kalan herhangi bir DNA numune kaldırmak için isteğe bağlı DNaz tedavisini takip etmek isterseniz, nükleaz içermeyen su 17μL pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Aksi takdirde, nükleaz ücretsiz su 20μL pelet tekrar süspansiyon ve 22 adıma geçin.
- (Opsiyonel DNaz tedavi) Qiagen RNaz-free DNaz seti kullanarak, 2μL Tampon RDD ve 1μL RNaz yeniden süspanse RNA ücretsiz DNaz sulandırılmış eklemek. Yavaşça karıştırın.
- (Opsiyonel DNaz tedavi) 37 ° C'de 30 dakika.
- (Opsiyonel DNaz tedavi) 2.5 mM EDTA ve inkübe 2μL 65 ° C 5 dakika DNaz inaktive. Kat daha uzun / yüksek sıcaklıklarda RNA düşmesine neden olarak inaktivasyon zaman veya sıcaklık aşmayın.
- Spektrofotometre tarafından RNA konsantrasyonu kontrol edin.
- -80 ° C'de RNA örnek Mağaza
- (Opsiyonel QC) Agilent BioAnalyzer kullanarak RNA kalitesini kontrol edin, ya da örnek denatüre edici bir jel üzerinde çalışıyor ve OD okumaları kontrol. (260nm ve 260/280 oranı)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritik Adımlar
Part 1 & 2
Senkron vaccinia enfeksiyonu kurma pek çok kritik adımlar vardır, virüsün ilk olmanın dikkatli sonication (veya trypzinizing), virüs parçacıkları parçalara ayırma için. Vaccinia toplayarak için son derece eğilimli ve virüs parçacıkları bozulması hücre bile enfeksiyon sağlamak için önemlidir. Senkron bir enfeksiyon ulaşmak için (2'den fazla), İçişleri Bakanlığı, her bir hücre enfekte yüksek sağlamak için kullanılan olmalıdır. Enfekte ve enfekte olmamış hücrelerin karışımı, enfeksiyonun çok sayıda mermi, zaman noktalarında heterojen karışımlar, ve asenkron viral ve konak transkripsiyonel yanıtları yol açacaktır. Enfeksiyon hücreleri üzerine virüs maksimum adsorpsiyon izin medya az miktarda yapılmalıdır. Buna ek olarak, matara ya da kültür yemekleri (her 10 dakikada bir) düzenli sallayarak balon genelinde virüs dağılımını sağlar ve hücrelerin kurumasına olmadığını sağlar.
Bölüm 4
1-Bromo-3-chloropropane (BCP), genomik DNA kontaminasyonu azaltmak için fenol yerine kullanılır. Bir sonraki isteğe bağlı DNAz tedavi (Qiagen RNAase Free-DNAz) da kalan genomik DNA ortadan kaldırmak için olabilir. Ikinci bir kloroform ekstraksiyonu eser miktarda bile, sonraki amplifikasyon adımları inhibe gibi, organik çözücü ekstraksiyonu tüm izlerini silmek için kullanılır. Total RNA ekstraksiyonu sonrası absorbans ölçerken / fenol BCP izleri 270Nm ani bir artış (260 nm'de standart pik ötesinde) olarak tespit edilebilir. Bu tür kirlenmelerin belirirse, amplifikasyon geçmeden önce RNA (filtre veya kolon-tabanlı bir RNA ekstraksiyon yöntemi kullanarak) re-extract. Minimum miktarda RNA amplifikasyon reaksiyon 100ng gerçekleştirmek için gerekli, ancak, 500-1000ng tercih edilir.
Uygulama / Önemi
Bu protokol sonucu etiketli RNA gen ekspresyonu yanıtları değerlendirmek için kültür enfekte hücreleri insan, viral veya özel mikroarray'ler melezleşmiştir olabilir. Mikroarray platformları değişir, bu nedenle etiketli prob hibridizasyon karışımının hazırlanması için üreticinin yönergelerini izleyin.
Özel olarak tasarlanmış bir poxvirus dizi 1 kullanarak, genler viral DNA replikasyonu transkript tespiti için gerekli olup olmadığını ya da "erken" ya da "geç" hibridizasyon sinyali zamanlaması dayalı ve genel kategoride sınıflandırmak için başardık. Biz her zaman sınıf genlerin transkripsiyon kesin olarak beklenen fonksiyonel kategoriler (yani, erken, orta ve geç genlerin beklenen) değişimi gözlemledik.
Bu çalışmada kullanılan yöntemler devam ediyor ve erken ya da geç çoğaltma döngüsü transkripsiyonu virüs genleri tahmin etmek mümkün olabilir, ancak transkript beri çift geç / erken organizatörü ile erken ve geç bir yararlanıcı genlerin karşı daha fazla zorluk sadece erken ayırt Geç zaman algılandı. Buna ek olarak, diziye literatürde RNA belirlenen ORF veya yukarı yönde bir ORF gelmiş gibi geç viral genlerin transkripsiyon ile çalıştırmak, dizi belirli bir prob / noktada sinyal etkileyebilir. Fayans dizileri bu sorunu çözmek için çalıştılar, ancak zorlukları hibridizasyon temelli yaklaşımlar 2,3,4 kullanarak transkripsiyon yoluyla çalıştırılan tespit kalır.
Ev Sahibi transkripsiyonel desenler de bu yöntemler kullanılarak tespit edilebilir. Ancak, vaccinia Konak yanıtları inhibe mekanizmaları çeşitli kodlar ve ev sahibi transkripsiyonel yanıtları diğer uyaranlara 5,6,7,8 göre azalabilir. Konak savunmasında yer alan birçok genin ifadesi enfeksiyondan sonra değişmiş olduğundan, konağın immün yanıtları karşı viral genlerin katkısı bu nedenle dikkate alınması gerekir.
Bu yöntemler kullanılarak, tüm viral genlerin transkripsiyonel zamanlama bir harita tespit ve bilinmeyen viral genlerin fonksiyonlarını sorgulamak için kullanılan olabilir. Buna ek olarak, bu yöntemler karmaşık virüs ve ev sahibi arasındaki diyalogu incelemek için kullanılabilir. Bu yöntemler, genel olarak diğer konak-patojen enfeksiyon sistemleri için geçerlidir. Ilgi patojen mRNA'ların polyadenylated yoksa, alternatif yöntemler doğrusal amplifikasyon olmadan, doğrudan toplam RNA etiketlemek için kullanılan olabilir. Hem ev sahibi ve Senkron enfeksiyon sırasında virüs gen ekspresyonu analiz ederek, bu yöntemler bize virüs bulaşmasına karşı konak hücre ortamının yanı sıra bilgisayar karşı savunmasını virüs etkileşim içgörü kazanmak için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Whitehead Enstitüsü'nden Fellows Fonları
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work. |
| BCP Phase Separation Reagent | Reagent | Molecular Research Center | BP151 | |
| RNase-Free DNase Set | Reagent | Qiagen | 79254 | DNase treatment is an optional step. |
References
- KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
