העברת גרעין לתוך ביציות עכבר

Summary

הסרט הזה ואת פרוטוקול נועדו לסייע למידה העברת גרעיני.

Abstract

העברת הגרעין אל תוך הביצית מופרית ניתן לשחזר את הפוטנציאל ההתפתחותי לתא מובחן. זה מוכיח כי התהליכים הבסיסיים, פיתוח הבחנה והזדקנות הם epigenetic ולא תהליכים גנטיים. הפיכות של תהליכים אלה פותחת אופקים מרגש במחקר בסיסי, ובעתיד הרחוק יותר, ברפואה רגנרטיבית. בשנת העכבר, בתאי גזע עובריים ניתן לגזור מעוברים משובטים preimplantation הבמה. אלה בתאי גזע עובריים יש את היכולת להצמיח את כל סוגי התאים של האורגניזם הבוגר. חשוב לציין, התאים האלה זהים מבחינה גנטית לתורם. אם החלים על האדם, זו תאפשר גזירת בתאי גזע מחולה. תאים אלה ניתן יהיה סוג מובחן לתוך התא הפגוע של החולה ולמד במבחנה, או להשתמש בו כדי להחליף תאים פגומים או חסרים. המחקר של העברת גרעיני העכבר נשאר חשוב כפי שהוא יכול להודיע ​​לנו על עקרונות תכנות מחדש של גרעיני. זה סרט המלווה את הפרוטוקול נועדו לסייע למידה העברת גרעיני העכבר, שיטה שפותחה לראשונה בקבוצה של פרופ 'Yanagimachi (וואקאיאמה et al. 1998).

Protocol

הכנות:

1. תיאור מפורט של superovulation ותרבות העובר microdrop ניתן למצוא במקום אחר ^2.
2. הכינו צלחת פטרי עם microdrops של המדיום תרבות העובר (למשל KSOM, Chemicon). מכסים עם שמן מינרלי (שמן מינרלי קבוצות יש לבדוק תאימות עם תרבות העובר). לאזן ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בתוספת 5% CO _2. (ב-Thermo Electron 3110 מים בחממה במעיל או שווה ערך)
3. הכן צלחת עבור בידוד של ביציות: טיפות המקום hepes שנאגרו CZB & hyaluronidase (0.1% w / v, Sigma) במחצית אחת צלחת ו HCZB במחצית השנייה. מכסים עם שמן מינרלי. שמור את המנה החמה על הבמה סוער של מיקרוסקופ לנתיחה.
4. הכן את המיקרוסקופ: מקום פיפטה החזקת בקוטר חיצוני של כ 50 מ 'μ (מעט קטן יותר מאשר קוטר של הביצית) ולאחר הפתיחה של כ 20 מ' μ בעריסה one פיפטה. Pipettes אחזקות קל לעשות עם הציוד הדרוש, מחט חולץ (סאטר מכשירים) ו microforge (Narishige), אך הם עשויים גם להיות שנרכשו Humagen.
   
   טען 3-5 l כספית μ לזנב של micropipette (קוטר פנימי 8 מ μ). הימנע נשפך כספית. להכין צלחת עם כמה טיפות קטנות של 11% כל אחד w / v PVP (polyvinylpyrrolidone) ב HCZB ו 5 μ g / ml cytochalasin ב 'HCZB. השתמש מכסה של צלחת פטרי ולא את המנה עצמה המכסה יש שפה קצר כי לא יתערב עם התנועה של החזקת ואת pipettes enucleation. יישר את פיפטה מחזיקה את פיפטה enucleation לירידה HCZB. לשאוב HZCB מעט לתוך קצה פיפטה מחזיקה.
5. הכנת התאים התורם תלוי בעיקר בסוג התא הניסוי החוקר מתכוון לבצע. באופן כללי, התאים התורם צריך להיות מטופלים עם אנזים פרוטאוליטי כגון טריפסין ושמר על קרח כדי להפחית את הדביקות עד ההעברה.
6. הומני להרדים עכברים 14-15 שעות לאחר מתן של hCG. קציר oviducts ולנתח אותם ב-HCZB hyaluronidase טיפות חמות. לאחר כ. 5 דקות, ביציות יהיו חופשיים בעיקר מתאי קומולוס. הם צריכים ואז לשטוף מספר פעמים HCZB, שטף אז נוספת מראש equilibrated טיפות KSOM, והמשיך בחממה עד enucleation.

Enucleation

מניפולציות נעשות עם micromanipulators הידראולי, (Narishige) על מיקרוסקופ הפוכה, כגון ניקון TE200. Micromanipulator piezo (Primetech) משמש לקידוח pellucida zona. שקצהו שטוח enucleation ו pipettes העברת ניתן לרכוש Humagen. נקו לשמן את פיפטה enucleation את טיפות PVP ידי גירוש טיפות כספית מיקרוסקופיים ידי aspirating וגירוש PVP. כדי למנוע את הדביקות של המחט, ההליך אותו יש לעשות בין כל קבוצה של ביציות, כי הם enucleated או הועברו.

מקום קבוצה קטנה של ביציות לתוך הירידה ב-HCZB cytochalasin. גודל הקבוצה צריך להיות מותאם לרמת הניסיון של החוקר. ביציות לא צריך להיות כל הזמן על הבמה יותר מ 20-30 דקות. הזזת מכשירים HCZB-B cytochalasin טיפות. פיפטה מחזיקה את פיפטה enucleation צריך להביא לכדי היערכות עם קו המשווה של הביצית. זה יהיה אפשרי אם פיפטה מחזיק בעל קוטר חיצוני כי הוא מעט קטן יותר הביצית עצמה. סיבוב הביצית עד ציר metaphase השבירה אחרת ניתן לראות. אם מתחיל לא יכול לראות את ציר, הצלחת metaphase ניתן לזהות באמצעות לצבוע DNA Hoechst תאורה UV, עם זאת, כי אינה תואמת ההתפתחות העוברית יעיל. מקם את ציר metaphase ב 03:00 והחזק אותו היטב עם פיפטה מחזיקה. החל פולסים piezo לחדור pellucida zona. גע צלחת metaphase עם פיפטה enucleation. לאחר התנגדות של ציר metaphase יכול להיות "הרגיש", לשאוב ציר ולמשוך את המחט. הציטופלסמה היא נוזל הביצית, ציר metaphase אולם מהלכים כמו גוש כאשר נגע עם פיפטה. נסו להפחית את כמות הציטופלסמה כי יוסר עם ציר. אחרי קבוצה של ביציות כבר enucleated, לשטוף אותם באמצעות מדיום תרבות העובר ולהכניס אותם לתוך החממה עד ההעברה. כמה ביציות enucleated לא צריך להיות מועבר אך צריך להיות מופעל לשמש מלאה עבור enucleation. ביציות אלו שבר בתוך כמה שעות, המציין enucleation מוצלח.

העברת גרעיני

המקום התאים לתוך פתרון PVP (11% ב PVP HCZB). אם לעצור שיבוטים רבים בשלב 1-התא, ריכוז PVP צריך להיות הוריד ל 5% או פחות. מערבבים היטב תאים שנינותשעות PVP. איסוף תאים עם טפטפת בקוטר פנימי מעט קטן יותר מאשר קוטר של התא. הממברנה של התא צריך לשבור על השאיפה. במקרים מסוימים, גירוש חוזרות השאיפה כמו גם את היישום של פולסים עדין piezo ניתן להשתמש כדי לשבור את התא התורם. ירידה חדשה של תאים התורם צריך להיעשות עם כל קבוצה של ביציות המועברים, כמו תאים התורם להיות דביק לאחר זמן מה. להזריק את התא התורם שבור זמן קצר לאחר שבירת הממברנה. עבור ההעברה, להתמקד קו המשווה של הביצית עצמה ולא את המטוס המשווני של pellucida zona, ולמקם את ההעברה פיפטה מחזיקה באותו המטוס. החזק את הביצית כולל חלק בציטופלסמה שלה בנחישות. לחדור pellucida zona באמצעות פולסים piezo. תביאו את גרעין התורם אל קצה פיפטה, ואז לדחוף את קצה פיפטה כמעט בצד השני של הביצית enucleated, קרוב פיפטה מחזיקה, מה שהופך תלם עמוק בתוך הביצית. לשאוב כמות קטנה מאוד של הציטופלסמה לתוך הביצית פיפטה, להחיל הדופק יחיד חלש piezo לשבור את קרום הביצית, להוציא את הגרעין התורם, לשלוף את המחט במהירות תוך aspirating על הממברנה cytoplasmic בקצה הימני של התלם. בו זמנית על ידי משיכת המחט aspirating, זה צריך להיות אפשרי כדי לסגור את החור שהותירו NT. זה "הסרת טכניקה חור תפחית את מספר ביציות כי lyse במהלך NT. שטפו את ביציות לשחזר KSOM ולהחזיר אותם בחממה במשך שעות 1-3.

הביצית הפעלה

הכן חצי צלחת עם טיפות MCZB סידן חופשי את החצי השני עם טיפות של סידן MCZB חינם פלוס 10mm Sr ^{2 +} ו - 5 μ g / ml cytochalasin B לעכב שחול הגוף הקוטב. לאזן למשך 30 דקות. לפי 5% CO ² באוויר. לשטוף היטב עוברים NT-MCZB סידן חינם ולאחר מכן למקם אותם בקבוצות קטנות בטיפות שונות של MCZB-סידן חופשי. מחזירים את המנה אל האינקובטור והתרבות של 5-6 שעות. כדי לשלוט על פרוטוקול ההפעלה מלאכותיים התנאים תרבות העובר, ללא enucleated ביציות יש להשתמש. הם יפתחו כמו עוברי parthenogenetic. לאחר ההפעלה, לשטוף את עוברי דרך עוברי KSOM מקום בחממה לתרבות לטווח ארוך. Pronuclei צריך להיות גלוי בנקודה זו בזמן, המעיד על העברת מוצלח.

תרבות העובר מדיה Cookbook

מאסטר מלחים

התחילו עם 980 מ"ל ultrapure H ₂ O בבקבוק 1 ליטר סטרילית

הוספת מרכיבים יבשים:

NaCl 4760 מ"ג (81 מ"מ) סיגמא S-5886
KCl 360 מ"ג (5mm) סיגמא P-5405
MgSO ₄ • 7H ₂ O 290 מ"ג (1.18mM) סיגמא M-2773
KH ₂ PO ₄ 160 מ"ג (1.17mM) סיגמא P-5655
EDTA 2NA 40 מ"ג (0.1mm) סיגמא E-6635
(ד) 1000 מ"ג גלוקוז (5.5mm) סיגמא G-6152

הוספת רכיבי נוזלי

Na-חומצת חלב (חומצה לקטית) 5.3 מ"ל & nbsp; Sigma 44263
Pen'Strep 10 מ"ל Gibco 15140-122

עבור מלחים MCZB במלאי:

סנן לעקר 500 מ"ל מלחי מאסטר (טוב 3-4 חודשים; חנות ב 4 ° C)

עבור מלחים HCZB במלאי:

התחל עם 500 מ"ל מלחי מאסטר

הוסף 50 מ"ג PVA (קר מסיסים; Sigma P-8136)

מערבבים במשך 30-60 דקות ועקר המסנן (טוב במשך 3 חודשים; חנות ב 4 ° C)

Ca ^{+ +} חינם MCZB (להפעלת ביציות של 5% CO ₂₎

התחל עם 99 מ"ל מלחי MCZB מניות

הוספת מרכיבים יבשים:

NaHCO ₃ 211 מ"ג Sigma S-5761

Na-pyruvate (חומצה pyruvic) 3 מ"ג Sigma P-4562

L-גלוטמין 15mg Sigma-G-8540

שור בסרום אלבומין (BSA) 500 מ"ג Sigma A-3311

מערבולת עד כל הרכיבים מומס, מסנן סטרילי.

HCZB (עבור המיקרומניפולציה באווירה הסביבה)

התחל עם 99 מ"ל מלחי HCZB מניות

הוספת מרכיבים יבשים:

Hepes Na-520 מ"ג Sigma H-3784

NaHCO ₃ 42 מ"ג Sigma S-5761

הוספת רכיבים נוזליים:

128 mM CaCl ₂ (18.8g / l) 1 מ"ל Sigma C-7902

התאם ל-pH 7.5 עם 1 N HCl

מערבולת עד מומס, מסנן סטרילי.

Discussion

מזל טוב!

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytochalastin B	Sigma-Aldrich		100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride			10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts			Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts			Start with 500 mL master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA	Sigma-Aldrich	P-8136	cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP			Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP	ICN Biomedicals		MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.