Fare Oosit içine Nükleer Transfer

Summary

Bu film ve protokol nükleer transfer öğrenmeye yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

Abstract

Döllenmemiş bir oosit içine Nükleer transfer farklılaşmış hücre gelişim potansiyeli geri yükleyebilirsiniz. Bu gelişme, farklılaşma ve yaşlanma altında yatan süreçlerin genetik süreçleri yerine epigenetik olduğunu göstermektedir. Bu süreçlerin reversibilite rejeneratif tıp, temel araştırma heyecan verici perspektifler açılır ve daha uzak bir gelecekte. Fare embriyonik kök hücreleri, klonlanmış preimplantasyon aşamasında embriyolardan elde edilebilir. Bu embriyonik kök hücreleri, yetişkin organizmanın tüm hücre tiplerinin yol vermek için yeteneği var. Önemlisi, bu hücrelerin genetik donör aynıdır. Varsa insan, bu, bir hastadan alınan kök hücrelerin türetme izin verecek. Bu hücreler daha sonra hastanın etkilenen hücre tipi içine farklılaştırılmış ve in vitro okudu veya zarar görmüş veya kaybolmuş hücreler değiştirmek için kullanılan olabilir. Nükleer yeniden programlama ilkeleri hakkında bizi bilgilendirmek gibi fare nükleer transfer çalışmaları önemini korumaktadır. Bu film ve beraberindeki protokol, fare nükleer transfer öğrenme yardımcı olmak için tasarlanmıştır, başlangıçta grup Prof. Yanagimachi (Wakayama ve ark 1998) bir yöntem geliştirdi.

Protocol

Hazırlıklar:

1. Süperovulasyon ve embriyo kültürü microdrop ayrıntılı bir açıklama, başka bir ^yerde 2 bulunabilir .
2. Petri embriyo kültür ortamı microdrops (örneğin KSOM, Chemicon) ile hazırlayın. Mineral yağ (mineral yağ toplu embriyo kültürü ile uyumluluk için test edilmelidir) ile kaplayın. 37 ° dengeye ° C hava artı% 5 CO _2. (Thermo-Elektron 3110 su ceketli inkübatör veya eşdeğeri)
3. Oositlerin izolasyonu için bir yemek hazırlayın: Hepes Yeri damla diğer yarısı çanağı ve HCZB bir yarısında (% 0.1 w / v, Sigma) hiyalüronidaz CZB tamponlu. Mineral yağ ile kaplayın. Diseksiyon mikroskobu ısıtılmış bir sahnede çanak sıcak tutun.
4. Yeri bir dış çapı yaklaşık 50 μ m (oosit çapı biraz daha küçük) bir holding pipet ve bir pipet tutucu yaklaşık 20 μ m bir açılış: mikroskop hazırlayın. Holding, pipetler, gerekli ekipman, bir iğne çektirmesi (Sutter Instruments) ve bir microforge (Narishige) ile yapmak kolaydır, ama onlar da Humagen satın alınabilir.
   
   Mikropipet (iç çapı 8 μ m) kuyruk 3-5 μ l cıva yükleyin. Cıva dökülen kaçının. Birkaç küçük damla her HCZB% 11 w / v PVP (Polyvinylpyrrolidone) ve 5 μ g / ml cytochalasin B HCZB bir yemek hazırlayın. Petri kabı kapağı yerine çanak kendisi tutarak ve enükleasyon pipetler hareketine engel olmayacak kısa bir jant kapağı gibi kullanın. Bir HCZB damla holding pipet ve enükleasyon pipet hizalayın. Holding pipet ucu içine biraz HZCB aspire.
5. Donör hücrelerinin hazırlanması, hücre tipi ve araştırmacı gerçekleştirmek niyetinde deney büyük ölçüde bağlıdır. Genel olarak, donör hücreleri gibi tripsin gibi proteolitik bir enzim ile tedavi ve yapışkanlık transferi kadar azaltmak için buz üzerinde tutulmalıdır olmalıdır.
6. Insancıl, hCG uygulandıktan sonra fareler 14-15 saat euthanize. Hasat siyon hatası ve onları sıcak HCZB-hiyalurinidaz damla teşrih. Daha sonra yaklaşık 5 dakika, oosit kümülüs hücreleri çoğunlukla ücretsiz olacak. Daha sonra, daha sonra ön dengelenmiş KSOM damla yıkanmış, HCZB birkaç kez yıkanmış ve enükleasyon kadar inkübatör muhafaza edilmelidir.

Enükleasyon

Nikon TE200 gibi ters bir mikroskop hidrolik mikromanipülatörler (Narishige), manipülasyonlar yapılmaktadır. Piezo mikromanipülatör (Primetech) zona pellusida delmek için kullanılır. Düz uçlu enükleasyon ve transferi pipetler Humagen satın alınabilir. Mikroskobik cıva damlacıkları atarak ve PVP aspire atarak temizleyin ve PVP damla enükleasyon pipet yağlayın. Iğne yapışkanlık önlemek için, aynı prosedür ya enükleasyon veya transfer oositlerin her grup arasında yapılmalıdır.

HCZB-cytochalasin B açılan küçük bir grup oosit yerleştirin. Grubun büyüklüğüne araştırmacının deneyim seviyesine adapte edilmelidir. Oosit 20-30 dakika daha uzun süre sahnede saklanmamalıdır. HCZB cytochalasin B damla aletleri taşıyın. Holding pipet ve enükleasyon pipet oosit ekvator düzleminde ile hizaya getirilmelidir. Holding pipetle oosit kendisi biraz daha küçük bir dış çapı varsa bu mümkün olacaktır. Farklı refraktif metafaz mili görülebileceği kadar bir oosit döndürün. Bir acemi mili göremiyorsanız, metafaz plaka verimli embriyonik gelişim ile uyumlu değildir ancak DNA boya Hoechst ve UV aydınlatma, kullanılarak tespit edilebilir. 3 saat metafaz mili yerleştirin ve holding pipet ile tutun. Zona pellusida nüfuz piezo darbeleri uygulayın. Enükleasyon pipet ile metafaz plaka dokunun. Metafaz mili direniş 'hissettim' olabilir sonra, iş mili aspirat ve iğneyi çıkartın. Pipet ile dokundu oosit sitoplazma sıvısı, metafaz mili ancak bir yığın olarak hareket eder. Mili ile kaldırılır sitoplazma miktarı azaltmayı deneyin. Oosit bir grup enükleasyon edildikten sonra, embriyo kültür ortamı ile yıkayın ve transferi kadar inkübatör içine yerleştirin. Bazı enükleasyon oosit transfer edilebilir olmalıdır ancak aktif olmalıdır ve enükleasyon için bir denetim görevi. Bu birkaç saat içinde oosit parçası, başarılı enükleasyon gösterir.

Nükleer transfer

PVP çözümü (11% HCZB nunda) içine yerleştirin hücreleri. 1-hücreli aşamada birçok klonlar tutuklama, PVP konsantrasyonu% 5 veya daha az düşürülmelidir. Mix hücreleri de zekâh PVP. Hücre çapı biraz daha küçük bir iç çapa sahip bir pipet ile hücreleri seçin. Hücre zarı, aspirasyon üzerine ayrılmalıyız. Bazı durumlarda, tekrarlayan kovma ve aspirasyon gibi nazik piezo bakliyat uygulama donör hücre kırmak için kullanılabilir. Donör hücreler bir süre sonra yapışkan hale donör hücreleri yeni bir düşüş, her grup aktarılan oosit ile yapılmalıdır. Membran kırarak kısa bir süre sonra kırık donör hücre enjekte edilir. Transferi için, ekvator düzleminde oosit zona pellusida kendisi yerine ekvator düzleminde odaklanmak ve aynı düzlemde transferi ve holding pipet pozisyon. Oosit sitoplazmasında bir parçası dahil sıkıca tutun. Piezo darbeleri kullanarak zona pellusida nüfuz. Pipet ucu donör çekirdeği getirin, sonra oosit derin bir karık, yakın holding pipet pipet ucu neredeyse enükleasyon oosit karşı tarafa itmek. Oosit sitoplazmasında pipet içine çok küçük bir miktar aspire, oosit zarı kırmak için tek bir zayıf piezo darbe uygulamak, donör çekirdeği çıkarma hızla karık sağ ucunda sitoplazmik membran aspire ederken iğneyi çıkartın. Aynı anda iğne çekilerek aspire, NT tarafından geride bıraktığı deliği kapatmak mümkün olmalıdır. Bu 'delik kaldırma tekniği NT sırasında lyse oosit sayısını azaltacaktır. KSOM yeniden inşa oosit yıkayın ve 1-3 saat süreyle inkübatör onları geri.

Oosit aktivasyonu

Bir yarım kalsiyum ücretsiz MCZB damlacıkları ve kalsiyum ücretsiz MCZB artı 10mM Sr ² damlacıkları ile diğer yarısı ile bir yemek hazırlayın ⁺ ve kutup vücut ekstrüzyon inhibe için 5 μ g / ml cytochalasin B. 30 dakika dengelenmesi. hava altında% 5 CO ^2. Kalsiyum ücretsiz MCZB iyi yıkayın ve NT embriyolar daha sonra küçük gruplar halinde kalsiyum ücretsiz MCZB farklı damla koyun. 5-6 saat için kuvöz ve kültüre çanak dönün. Yapay aktivasyon protokol ve embriyo kültür koşulları kontrol etmek için, non-enükleasyon oosit kullanılmalıdır. Parthenogenetic embriyolar gibi gelişecektir. Aktivasyon ardından, uzun vadeli bir kültür KSOM ve yer embriyolar inkübatör ile embriyoların yıkayın. Pronuclei başarılı transferi belirten, bu kez noktada görünür olmalıdır.

Embriyo Kültürü Medya Yemek Tarifleri

Ana Tuzlar

Steril 1 L şişe 980 mL ultra saf H ₂ O ile başlayın .

Kuru bileşenlerini ekle:

NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886
KCl 360 mg (5mM) Sigma P-5405
MgSO ₄ • 7H ₂ O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773
KH ₂ PO ₄ 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655
EDTA 2NA 40 mg (0.1mm) Sigma E-6635
Glikoz (D) 1000 mg (5.5mm), Sigma G-6152

Sıvı Bileşenleri Ekle

Na-laktat (laktik asit) 5.3 mL & nbsp; Sigma 44.263
Pen'Strep 10 ml Gibco 15.140-122

MCZB Stok Tuzlar için:

Sterilize Filtre 500 ml ana tuzları (4 mağaza ° C için iyi bir 3-4 ay)

HCZB Stok Tuzlar için:

500 ml ana tuzları ile başlayın

(Sigma P-8136 soğuk çözünür) 50 mg PVA

30-60 dk ve filtre steril (4 mağaza ° C 3 ay için iyi) karıştırın

Ca ^{+ +} Ücretsiz MCZB (% 5 CO ₂ oosit aktivasyonu için)

99 ml MCZB stok tuzları ile başlayın

Kuru bileşenlerini ekle:

NaHCO ₃ 211 mg Sigma S-5761

Na-piruvat (pirüvik asit) 3 mg Sigma P-4562

L-Glutamine 15mg Sigma G-8540

Sığır serum albumini (BSA) 500 mg Sigma A-3311

Tüm bileşenlerin kadar Swirl çözülür, steril filtre.

HCZB (ortam atmosferde mikromanipülasyon için)

99 ml HCZB stok tuzları ile başlayın

Kuru bileşenlerini ekle:

HEPES-Na 520 mg Sigma H-3784

NaHCO ₃ 42 mg Sigma S-5761

Sıvı bileşenlerini ekle:

128 mM CaCl ₂ (18.8g / l) 1 ml Sigma C-7902

1 N HCl ile pH 7.5 'e ayarlayın.

Swirl eriyene kadar steril filtre.

Discussion

İyi şanslar!

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytochalastin B	Sigma-Aldrich		100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride			10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts			Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts			Start with 500 mL master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA	Sigma-Aldrich	P-8136	cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP			Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP	ICN Biomedicals		MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.