Измерение экзоцитоза в Нейроны Использование FM-маркировки

Summary

Возможность измерения кинетики пузырьков релиз может помочь дать представление о некоторых основах нейротрансмиссии. Здесь мы использовали в режиме реального времени изображения пузырьков помечены красным флуоресцентным красителем FM 4-64 для измерения скорости пресинаптическое высвобождение пузырьков в гиппокампе нейронов культур.

Abstract

Возможность измерения кинетики пузырьков релиз может помочь дать представление о некоторых основах нейротрансмиссии. Здесь мы использовали в режиме реального времени изображения пузырьков помечены FM краситель для контроля скорости пресинаптическое высвобождение пузырьков. FM4-64 представляет собой красный флуоресцентный амфифильных стирил краситель, который встраивается в мембраны синаптических пузырьков как эндоцитоза стимулируется. Липофильные взаимодействия причиной красителя значительно увеличить флуоресценции, таким образом, излучающие яркий сигнал, когда связанные с пузырьками и номинальной, когда во внеклеточной жидкости. После мытья шаг используется, чтобы помочь устранить внешние красителя в плазме мембраны, оставшиеся FM сосредоточен в пузырьках, а затем изгнали когда экзоцитоза индуцирована очередной раунд электрической стимуляции. Скорость выделения пузырьков измеряется от последующем снижении флуоресценции. С FM красителя может быть применено внешнее и скоротечно, это полезный инструмент для установления ставок экзоцитоз в нейрональных культурах, особенно при сравнении ставок между трансфицированных синапсов и соседних boutons контроля.

Protocol

Клетки: Крыса (или мыши) первичных нейронов гиппокампа культур (14-28 дней в пробирке).

Стимуляция: Электрическое, доставляется через двумя платиновыми электродами; 70-90 мВ

Микроскопия: 60x объектив нефти на перевернутую ПЗС-флуоресцентного микроскопа.

Программное обеспечение: Slidebook (Intelligent изображений Инновации, Санта-Моника, Калифорния)

Смотрите дополнительную страницу методы подробности

1. Теплый HEPES-солевой буфер (ОБД) до комнатной температуры. Добавить глютамат рецепторов APV (50 мкМ конечной концентрации) и CNQX (10 мкМ финал). Каждый FM эксперимент как правило, требует 20-30 мл HBS. Для работы в концентрации 10 мкМ FM 4-64 (Molecular Probes), разбавить исходный раствор 1:1000 в HBS (с антагонистами добавлено). Сделайте 2 мл FM soln для каждого эксперимента. Обложка решение с фольгой, чтобы предотвратить воздействие света.
   
   
2. Горы покровное содержащих нейронов на электрод камеры. Убедитесь, что носитель в камере на одном уровне с верхней части камеры и полностью покрывает электродов. Удалите излишки раствора из нижней части покровное. Добавьте масло, чтобы линзы (при использовании масла линзы).
   
   
3. Настройка перфузии аппарата. Вначале промыть несколько мл каждого следующего в определенном порядке (пусть каждый поток тщательно прежде, чем добавить следующее): вода, этиловый спирт, воду, затем HBS. Затем добавьте HBS (за исключением нескольких мл добавить вручную в будущих шагов) и закройте перфузии. Настройка выхода перфузии и всасывания на противоположных сторонах по краям покровного стекла. Лучше всего, если перфузии выходе достигает в камеру, где, как всасывания должна лежать на самом верху. При добавлении HBS (либо перфузии или вручную), открытой всасывающей и корректировать свою позицию, с тем, что он поддерживает средства массовой информации на должном уровне, только полностью покрывают электроды.
   
   
4. Ищите области на покровное вы хотите изображения и попытаться грубо привести его в фокусе. Оптимальные области содержат много синапсов, но не должна быть настолько плотной, что отдельные процессы становятся неразличимыми. Там не должно быть до минимально органов клетки, посторонние мембран (например, скопления астроцитов), или другие неспецифические материалов (таких как нибудь вкусненькое). Красителя FM могут неспецифически придерживаться этих.
   
   
5. Используйте "РГ" фильтр куб (который возбуждает зеленым светом и собирает красно-дальнего красного выбросов). Установить SlideView "захвата предпочтений", чтобы поставить 900 AP, от 10 Гц при наступлении образ 0 (обычно от 300 до 900 точек доступа используется для загрузки этого стимула). В окне изображения, выберите "флуоресцентных-VIS-красный" настройки фильтра и изменения времени экспозиции до 100 мс. Выключите все уже существующие настройки timelapse. Не следует принимать какие-либо изображения, пока вы готовы приступить к стимуляции.
   
   
6. Убедитесь, что на всасывание / открыть. Быстрое добавление FM soln (2 мл) в камере на противоположной стороне всасывания. Немедленно нажмите хорошо в окне изображения, чтобы принять образ и начать стимуляцию. Подождите 30-45 сек после стимуляции, а затем быстро промыть FM, добавив ~ 2 мл HBS (я делаю это вручную с помощью пипетки, но это также может быть сделано путем перфузии).
   
   
7. Вымойте FM с помощью ОБД перфузии в течение ~ 10 минут. Скорость потока должна быть 1-1,5 мл / мин. В течение этого мыть шаг, изменение предпочтений стимуляции, так что начало стимуляции начинается @ изображение 10 (обычно от 900 до 1200 точек при 10 Гц используются для этого destaining стимула). Около 7 минут на мытье, дважды проверьте настройки (начало стимула на изображение 10). Теперь, используя небольшое окно фокус выбрать и сосредоточиться субрегионе. Убедитесь, что стимуляция параметры были изменены, прежде чем перейти к следующему шагу. Возьмите одну картинку, чтобы увидеть, если мыть завершения (индивидуальных синапсов, должны быть четко точечные). Если нет, то увеличение расхода дополнительных 0.5mL/min, и ждать еще 2 минуты.
   
   
8. После мытья завершения настройки экспозиции времени, сколько необходимо, чтобы продолжать получать хороший, четкий сигнал (обычно в пределах 50-100 мс. Выдержки раз должно быть сведено к минимуму из-за быстрого фотообесцвечивания FM). Затем установите timelapse предпочтения принять 38 изображений каждые 5 секунд. Проверьте перфузии сделать там достаточно HBS в течение еще 5 минут, и оставить перфузии течет. Начало timelapse начать destaining.
   
   
9. После destain, изменение параметров стимуляции для доставки 1200 AP @ 10 Гц (обычно от 1200 до 2000 точек доступа используют для этого заключительного шага) на изображении 0. Выключите timelapse настройки и принять единый образ начать стимуляцию. Перфузии должны все еще быть течет Этот шаг поможет удалить все оставшиеся везикулярного FM краситель, с целью определения базовых / "общего разборных" флуоресценции. После стимул закончится, выключите стимуляции настройки, довести регион в фокусе. Закрыть перфузии и всасывания, А затем взять два последних изображения линии. Либо отдельные изображения или Z-стека изображений (с шагом 0,5 мкм) могут быть приняты. Z-стеки полезно в случае, произошел сдвиг в плоскости фокуса во время эксперимента.
   
   
10. FM-эксперимент сделано. Если сразу делать больше экспериментов, объектива и камеры должны быть очищены от каждого испытания, но перфузии аппарат не должен быть очищен только после окончательного эксперимента. Промойте аппарат полностью с водой, затем этанолом.

Discussion

Как 300 потенциалов действия (AP) является достаточным, чтобы вызвать по меньшей мере один раунд пузырьков переработки, загрузки стимулом 300 точек или более часто дают этикетку переработки пул везикул. Хотя более интенсивной загрузки стимулы, такие как 900 точек доступа, может позволить номинальный ряд дополнительных пузырьков, подлежащих маркировке, это также увеличивает количество времени красителя можете вставлять во внеклеточной оболочки, что ведет к повышению неспецифического окрашивания. Я обнаружил, мыть шаг к иметь решающее значение для обеспечения надлежащего destaining. Важно, чтобы заливать с расходом от 1 до 1,5 мл в минуту, как правило, 10 + 2 минут. Одно изображение может быть принято ~ 7 минут после мытья для мониторинга масштабов красителя удаления. При необходимости, скорость потока и или мыть время может быть немного увеличена. Для наших экспериментах было нежелательно для мытья приступить больше 10-12 минут, поскольку это увеличивает вероятность потери пузырьков маркировки через события спонтанного экзоцитоза, которые могут возникнуть даже тогда, когда клетка находится в покое. Для destaining шагом, от 900 до 1200 точек доступа вводили освободить всех меченых пузырьков. Кроме того, другой от 1200 до 2000 точек доступа были часто дается для получения базового значения "разборных флуоресценции", используется для нормализации destaining данных.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APV	Sigma-Aldrich	A5282
FM 4-64	Molecular Probes, Life Technologies	T-3166
CNQX disodium salt	Sigma-Aldrich	C-239