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Biology

测量中使用FM标签的神经元的胞外分泌

doi: 10.3791/117 Published: November 30, 2006

Summary

囊泡释放动力学的能力来衡量,可以帮助提供洞察到一些神经递质的基础。在这里,我们采用实时成像与红色荧光染料FM 4-64标记,以测量在海马神经元的文化突触前囊泡释放率的囊泡。

Abstract

囊泡释放动力学的能力来衡量,可以帮助提供洞察到一些神经递质的基础。在这里,我们使用实时成像与FM染料标记,以监测囊泡突触前囊泡释放率。 FM4 - 64是一个红色的荧光双亲苯乙烯染料嵌入到突触小泡的膜,内吞作用是刺激。亲脂相互作用导致的染料,大大提高了荧光,从而散发出耀眼的的信号时,囊泡和的名义,在细胞外液时相关。经过清洗的步骤是用来帮助去除质膜的内外部染料,其余的FM是集中在囊泡,然后被驱逐又一轮的电刺激诱导的胞外分泌时。囊泡释放率是测量荧光的产生减少。由于调频染料可以适用于外部和瞬时,它是一个有用的工具,用于确定在神经元文化的胞外分泌率,尤其是在比较之间转突触和相邻的控制boutons率。

Protocol

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细胞:大鼠(或鼠标)海马(14-28天)在体外神经元文化。

刺激:电器,通过交付两个铂电极; 70-90毫伏

显微镜的60X石油镜头:一个倒置的CCD荧光显微镜。

软件:Slidebook(智能成像创新,圣莫尼卡,加利福尼亚)

进一步详情请参阅页的补充方法

  1. 暖的HEPES缓冲液(HBS)至室温。添加谷氨酸受体拮抗剂APV(终浓度为50微米)和CNQX(10μM决赛)。每个FM实验通常需要20-30毫升哈佛商学院。对于工作的10微米调频4-64(分子探针)的浓度,在哈佛商学院的稀释原液1:1000(与拮抗剂添加)。每个实验2毫升调频soln。用铝箔覆盖的解决方案,以防止光线照射。

  2. 安装在盖玻片含有的神经元在电极上腔。检查室媒体室顶部的水平,并完全覆盖的电极。删除任何多余的溶液从底部的盖玻片。新增石油镜头(如果使用油镜头)。

  3. 成立灌注仪器。先用几毫升以下的每个给定的顺序(加入未来之前,让每一个流彻底):水,乙醇,水,那么哈佛商学院。接下来添加哈佛商学院(保存在今后的步骤手工添加几毫升),并关闭灌注。在盖玻片边缘设置灌注口两侧的吸力。这是最好的,如果灌注插座达到进入会议厅,其中作为吸应休息在最高层。虽然加入哈佛商学院(灌注或手工),打开的吸力,并调整其位置,使其保持在合适的水平完全覆盖电极媒体。

  4. 看该地区的盖玻片上,你想的形象,并尝试大致把它重点。优化区域含有许多突触,但不应该如此密集的单独的进程变得难以区分。应该有没有最小的细胞体,多余的膜(如星形胶质细胞的团块),或其他非特异性材料(如皮棉)。 FM染料可能非特异性坚持这些。

  5. 使用“工作组”过滤立方体(激发绿灯,并收集红远红排放)。 Slideview“捕捉偏好”提供10Hz的图像后,发病900 AP的设置0(通常为300至900的AP使用此加载刺激)。在图像窗口中,选择“荧光与红色的”过滤器设置,改变曝光时间为100 ms。关闭任何预先存在的timelapse设置。不要采取任何图像,直到您准备开始刺激。

  6. 确保吸力/打开。快速添加FM soln(2毫升)室在另一端的吸。在图像窗口中立即按好了图像,并开始刺激。刺激后等待30-45秒,然后迅速洗出调频加入哈佛商学院(我用吸管的手,但是这也可以通过灌注完成)〜2毫升。

  7. 通过灌注〜10分钟,洗净,与哈佛商学院的调频。流速应该是1-1.5毫升/分钟。在此清洗步骤,改变刺激的偏好,以便刺激发病开始@ 10图像(通常为900至1200的AP @ 10赫兹这脱色刺激)。入洗约7分钟,仔细检查的喜好(刺激呈现在图像10)。现在使用小焦点的窗口中选择一个次区域和重点。确保刺激的设置已被更改,然后再进行下一步。以一个单一的形象,看是否洗净完成(个别突触应明确punctated)。如果不增加额外0.5mL/min的流速,再等2分钟。

  8. 一旦清洗完成后,进行必要的调整曝光时间仍收到良好的,明确的信号(通常在50-100毫秒。曝光时间应尽量减少由于快速漂白的FM)。然后设置timelapse喜好采取每5秒38图像。检查的灌注,使有足够的哈佛商学院5分钟,并留下灌注流动。从timelapse开始脱色。

  9. destain后,改变刺激的设置,交付后的图像0 1200 AP @ 10HZ(通常为1200至2000年的AP使用这最后一步)。关闭的timelapse设置,并采取单一的形象,开始刺激。灌注仍然应该流淌这一步,将有助于消除任何剩余的水泡调频染料,以确定基线/“总释放的”荧光。刺激结束后,关闭的刺激设置,将成为关注的焦点地区。关闭灌注和吸,然后采取两个最终的基准图像。无论是单个图像或Z - Stack的图像(0.5微米步骤),可采取。 Z轴堆叠有用的情况下,在实验过程中有一个在焦平面转变。

  10. 调频实验已经完成。如果立即这样做更多的实验,镜头和分庭应清洗之间的每一次试验,但灌注仪器不需要直到最后的实验后清洗。完全与水,再用乙醇冲洗设备。

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Discussion

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300动作电位(AP)的是足以诱发囊泡循环至少有一个全面,装载了300接入点或更是经常给标签的囊泡回收池刺激。虽然更加激烈负荷刺激,如900的AP,可能会允许必须标明的其他囊泡的名义,这也增加了染料可以嵌入外膜的时间,从而导致更多的非特异性染色。我已经找到了清洗步骤是至关重​​要的,以确保正确的脱色。重要的是要灌注流速为每分钟1至1.5毫升,一般为10 + 2分钟。 〜7分钟后洗净,监察染料去除的程度,可以采取单一图像。如果有必要,流量和或洗时间可略有增加。对于我们的实验,它是不可取的洗着手,因为这增加了通过自发的胞吐事件可能发生甚至处于静止状态时,细胞失去囊泡标签的可能性大于10-12分钟。对于脱色步骤,900至1200的AP管理,释放所有标记的​​囊泡。此外,另有1200至2000年的AP往往给获得“释放的荧光”的基准值,用于脱色数据正常化。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

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References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
测量中使用FM标签的神经元的胞外分泌
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Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).More

Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

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