测量中使用FM标签的神经元的胞外分泌

Summary

囊泡释放动力学的能力来衡量，可以帮助提供洞察到一些神经递质的基础。在这里，我们采用实时成像与红色荧光染料FM 4-64标记，以测量在海马神经元的文化突触前囊泡释放率的囊泡。

Abstract

囊泡释放动力学的能力来衡量，可以帮助提供洞察到一些神经递质的基础。在这里，我们使用实时成像与FM染料标记，以监测囊泡突触前囊泡释放率。 FM4 - 64是一个红色的荧光双亲苯乙烯染料嵌入到突触小泡的膜，内吞作用是刺激。亲脂相互作用导致的染料，大大提高了荧光，从而散发出耀眼的的信号时，囊泡和的名义，在细胞外液时相关。经过清洗的步骤是用来帮助去除质膜的内外部染料，其余的FM是集中在囊泡，然后被驱逐又一轮的电刺激诱导的胞外分泌时。囊泡释放率是测量荧光的产生减少。由于调频染料可以适用于外部和瞬时，它是一个有用的工具，用于确定在神经元文化的胞外分泌率，尤其是在比较之间转突触和相邻的控制boutons率。

Protocol

细胞：大鼠（或鼠标）海马（14-28天）在体外神经元文化。

刺激：电器，通过交付两个铂电极; 70-90毫伏

显微镜的60X石油镜头：一个倒置的CCD荧光显微镜。

软件：Slidebook（智能成像创新，圣莫尼卡，加利福尼亚）

进一步详情请参阅页的补充方法

1. 暖的HEPES缓冲液（HBS）至室温。添加谷氨酸受体拮抗剂APV（终浓度为50微米）和CNQX（10μM决赛）。每个FM实验通常需要20-30毫升哈佛商学院。对于工作的10微米调频4-64（分子探针）的浓度，在哈佛商学院的稀释原液1:1000（与拮抗剂添加）。每个实验2毫升调频soln。用铝箔覆盖的解决方案，以防止光线照射。
   
   
2. 安装在盖玻片含有的神经元在电极上腔。检查室媒体室顶部的水平，并完全覆盖的电极。删除任何多余的溶液从底部的盖玻片。新增石油镜头（如果使用油镜头）。
   
   
3. 成立灌注仪器。先用几毫升以下的每个给定的顺序（加入未来之前，让每一个流彻底）：水，乙醇，水，那么哈佛商学院。接下来添加哈佛商学院（保存在今后的步骤手工添加几毫升），并关闭灌注。在盖玻片边缘设置灌注口两侧的吸力。这是最好的，如果灌注插座达到进入会议厅，其中作为吸应休息在最高层。虽然加入哈佛商学院（灌注或手工），打开的吸力，并调整其位置，使其保持在合适的水平完全覆盖电极媒体。
   
   
4. 看该地区的盖玻片上，你想的形象，并尝试大致把它重点。优化区域含有许多突触，但不应该如此密集的单独的进程变得难以区分。应该有没有最小的细胞体，多余的膜（如星形胶质细胞的团块），或其他非特异性材料（如皮棉）。 FM染料可能非特异性坚持这些。
   
   
5. 使用“工作组”过滤立方体（激发绿灯，并收集红远红排放）。 Slideview“捕捉偏好”提供10Hz的图像后，发病900 AP的设置0（通常为300至900的AP使用此加载刺激）。在图像窗口中，选择“荧光与红色的”过滤器设置，改变曝光时间为100 ms。关闭任何预先存在的timelapse设置。不要采取任何图像，直到您准备开始刺激。
   
   
6. 确保吸力/打开。快速添加FM soln（2毫升）室在另一端的吸。在图像窗口中立即按好了图像，并开始刺激。刺激后等待30-45秒，然后迅速洗出调频加入哈佛商学院（我用吸管的手，但是这也可以通过灌注完成）〜2毫升。
   
   
7. 通过灌注〜10分钟，洗净，与哈佛商学院的调频。流速应该是1-1.5毫升/分钟。在此清洗步骤，改变刺激的偏好，以便刺激发病开始@ 10图像（通常为900至1200的AP @ 10赫兹这脱色刺激）。入洗约7分钟，仔细检查的喜好（刺激呈现在图像10）。现在使用小焦点的窗口中选择一个次区域和重点。确保刺激的设置已被更改，然后再进行下一步。以一个单一的形象，看是否洗净完成（个别突触应明确punctated）。如果不增加额外0.5mL/min的流速，再等2分钟。
   
   
8. 一旦清洗完成后，进行必要的调整曝光时间仍收到良好的，明确的信号（通常在50-100毫秒。曝光时间应尽量减少由于快速漂白的FM）。然后设置timelapse喜好采取每5秒38图像。检查的灌注，使有足够的哈佛商学院5分钟，并留下灌注流动。从timelapse开始脱色。
   
   
9. destain后，改变刺激的设置，交付后的图像0 1200 AP @ 10HZ（通常为1200至2000年的AP使用这最后一步）。关闭的timelapse设置，并采取单一的形象，开始刺激。灌注仍然应该流淌这一步，将有助于消除任何剩余的水泡调频染料，以确定基线/“总释放的”荧光。刺激结束后，关闭的刺激设置，将成为关注的焦点地区。关闭灌注和吸，然后采取两个最终的基准图像。无论是单个图像或Z - Stack的图像（0.5微米步骤），可采取。 Z轴堆叠有用的情况下，在实验过程中有一个在焦平面转变。
   
   
10. 调频实验已经完成。如果立即这样做更多的实验，镜头和分庭应清洗之间的每一次试验，但灌注仪器不需要直到最后的实验后清洗。完全与水，再用乙醇冲洗设备。

Discussion

300动作电位（AP）的是足以诱发囊泡循环至少有一个全面，装载了300接入点或更是经常给标签的囊泡回收池刺激。虽然更加激烈负荷刺激，如900的AP，可能会允许必须标明的其他囊泡的名义，这也增加了染料可以嵌入外膜的时间，从而导致更多的非特异性染色。我已经找到了清洗步骤是至关重​​要的，以确保正确的脱色。重要的是要灌注流速为每分钟1至1.5毫升，一般为10 + 2分钟。 〜7分钟后洗净，监察染料去除的程度，可以采取单一图像。如果有必要，流量和或洗时间可略有增加。对于我们的实验，它是不可取的洗着手，因为这增加了通过自发的胞吐事件可能发生甚至处于静止状态时，细胞失去囊泡标签的可能性大于10-12分钟。对于脱色步骤，900至1200的AP管理，释放所有标记的​​囊泡。此外，另有1200至2000年的AP往往给获得“释放的荧光”的基准值，用于脱色数据正常化。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APV	Sigma-Aldrich	A5282
FM 4-64	Molecular Probes, Life Technologies	T-3166
CNQX disodium salt	Sigma-Aldrich	C-239