Summary
A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com o corante fluorescente vermelho FM 4-64 para medir a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas no hipocampo culturas neuronal.
Abstract
A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com corante FM para monitorar a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas. FM4-64 é um corante vermelho anfifílicos fluorescentes styryl que incorpora nas membranas das vesículas sinápticas como endocitose é estimulado. Interações lipofílicas fazer com que a tintura para aumentar grandemente a fluorescência, assim emitindo um sinal luminoso quando associada a vesículas e uma nominal quando no líquido extracelular. Após uma etapa de lavagem é usado para ajudar a remover corante externa dentro da membrana plasmática, a FM restante é concentrado dentro das vesículas e depois é expelido quando exocitose é induzida por outra rodada de estimulação elétrica. A taxa de liberação de vesículas é medido a partir da queda da fluorescência. Desde FM coloração pode ser aplicada externa e transitoriamente, é uma ferramenta útil para determinar as taxas de exocitose em culturas de neurônios, especialmente quando se comparam as taxas entre as sinapses e transfectadas boutons controlo vizinhas.
Protocol
Células: Rat (ou mouse) principal do hipocampo culturas neuronais (14-28 dias in vitro).
Estimulação: Elétrica, entregues através de dois eletrodos de platina; 70-90 mV
Microscopia: lente 60x de óleo em um microscópio invertido CCD fluorescente.
Software: Slidebook (Intelligent imagem Innovations, Santa Monica, CA)
Consulte a página métodos complementares para mais detalhes
- Quente HEPES-salina tamponada (HBS) à temperatura ambiente. Adicione o receptor de glutamato antagonistas APV (50 mM de concentração final) e CNQX (10 mM final). Cada experimento FM geralmente requer 20-30 mL HBS. Para trabalhar concentração de 10 mM FM 4-64 (Molecular Probes), diluir solução estoque 1:1000 em BH (com antagonistas acrescentado). Fazer 2 mL FM Soln para cada experimento. Cubra com papel alumínio solução para evitar exposição à luz.
- Montar a lamínula contendo os neurônios para a câmara de eletrodo. Verifique se a mídia na câmara é o nível com o topo da câmara e cobre completamente os eletrodos. Remova qualquer excesso de solução de baixo da lamínula. Adicione o óleo para a lente (se estiver usando uma lente de petróleo).
- Configurar o aparelho de perfusão. Primeiro enxaguar com alguns mililitros de cada um seguindo os na ordem dada (deixar que cada um fluxo completamente antes de adicionar o seguinte): água, água, etanol, então HBS. Em seguida adicione o HBS (salvo alguns mililitros para adicionar à mão em etapas futuras) e fechar a perfusão. Configurar a saída de perfusão e de sucção em lados opostos nas bordas da lamínula. É melhor se a saída de perfusão chega na câmara, onde, como a sucção deve descansar no topo. Ao adicionar HBS (quer por perfusão ou com a mão), abra a sucção e ajustar sua posição de modo que mantém a mídia da direita em nível de apenas cobrir completamente os eletrodos.
- Procure a área na lamela que você deseja para a imagem e tentar trazê-lo mais ou menos em foco. Áreas ideais contêm muitas sinapses, mas não deve ser tão densa que tais processos individuais tornam-se indistinguíveis. Não deve haver-to-mínimo corpos celulares, membranas externa (tais como aglomerados de astrócitos), ou outros materiais não-específicos (tais como fiapos). O corante pode FM inespecificamente aderir a estas.
- Use o "GT" cubo de filtro (que excita com luz verde e vermelha recolhe-to-longe emissões vermelho). Set "preferências capturar" SlideView para entregar 900 AP a 10Hz sobre o início da imagem 0 (tipicamente 300-900 APs são usados para este estímulo de carga). Na janela de imagem, selecione a opção "fluo-vis-vermelho" configurações de filtro e mudar o tempo de exposição a 100 ms. Desligue quaisquer definições pré-existentes timelapse. Não tome todas as imagens até que você esteja pronto para começar a estimulação.
- Certifique-se que a sucção é on / aberto. Adicionar rapidamente o Soln FM (2 mL) para a câmara na extremidade oposta da sucção. Imediatamente pressione ok na janela de imagem para obter uma imagem e começar a estimulação. Esperar 30-45 segundos após a estimulação e então rapidamente lavar FM adicionando ~ 2 mL da HBS (eu faço isso à mão com uma pipeta, mas isso também pode ser feita por perfusão).
- Lave o FM com HBS, através de perfusão para ~ 10 minutos. A vazão deve ser 1-1,5 mL / min. Durante esta etapa de lavagem, alterar as preferências de estímulo para que o início da estimulação começa @ image 10 (tipicamente 900-1200 APs @ 10 Hz são usados para este estímulo descoloração). Cerca de 7 min para a lavagem, verifique as preferências (início de estímulo na imagem 10). Agora, usando a janela do pequeno foco escolher e focar uma sub-região. Verifique se as configurações de estimulação foram alterados antes de prosseguir para a próxima etapa. Dê uma única imagem para ver se a lavagem completa (sinapses individuais devem ser claramente punctated). Se não, aumentar a taxa de fluxo de um 0.5mL/min adicionais, e esperar mais 2 minutos.
- Depois de lavagem é completa, ajustar o tempo de exposição necessário para continuar a receber um sinal bom, claro (geralmente entre 50-100 ms. Exposição vezes deve ser minimizado devido à fotodegradação rápida da FM). Em seguida, defina as preferências timelapse a tomar 38 imagens a cada 5 segundos. Verifique a perfusão para fazer há bastante HBS por mais 5 minutos, e deixar fluir a perfusão. Iniciar timelapse para começar a descoloração.
- Depois destain, alterar as configurações de estímulo para entregar 1.200 AP @ 10Hz (tipicamente 1200-2000 APs são usados para esta etapa final) sobre a imagem 0. Desativar as configurações timelapse e tomar uma única imagem para começar a estimulação. A perfusão deve ainda estar fluindo Este passo ajudará a remover qualquer restantes vesicular corante FM, a fim de determinar de base / "total releasable" fluorescência. Após o estímulo é terminado, desligue as definições de estimulação, traga a região em foco. Feche a perfusão e de sucção, E depois tome duas imagens de referência final. De qualquer imagem ou Z-stack imagens (passos de 0,5 mm) podem ser tomadas. Z-stacks são úteis no caso de haver uma mudança no plano de foco durante o experimento.
- Sua experiência FM é feito. Se imediatamente fazer mais experimentos, a lente ea câmara devem ser limpos entre cada tentativa, mas o aparelho de perfusão não precisa ser limpo após o experimento final. Enxágüe completamente o aparelho com água, então etanol.
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Discussion
De 300 potenciais de ação (APs) é suficiente para induzir, pelo menos, uma rodada de reciclagem de vesícula, um estímulo de carga de 300 ou mais APs muitas vezes é dado para rotular a piscina de reciclagem de vesículas. Apesar de estímulos de carga mais intensa, tais como 900 APs, pode permitir que um número nominal de vesículas adicional a ser rotulados, isso também aumenta a quantidade de tempo que o corante pode incorporar nas membranas extracelulares, levando a uma maior coloração não específica. Eu encontrei a etapa de lavagem a ser fundamental para garantir descoloração adequada. É importante para perfundir com taxa de fluxo de 1-1,5 mL por minuto, geralmente para 10 + 2 minutos. Uma única imagem pode ser tomada a 7 minutos para a lavagem para acompanhar o grau de remoção de corante. Se necessário, a taxa de fluxo e ou tempo de lavagem pode ser ligeiramente aumentada. Para nossos experimentos não seria desejável para a lavagem de proceder maior do que 10-12 minutos, pois isso aumenta a probabilidade de perder vesícula rotulagem através de eventos exocitose espontânea que pode ocorrer mesmo quando a célula está em repouso. Para a etapa de descoloração, 900-1200 APs foram administradas a libertação de todos os vesículas rotulados. Além disso outra APs 1200-2000 foram muitas vezes dada para obter um valor base de "fluorescência releasable", usados para normalizar os dados de descoloração.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| FM 4-64 | Molecular Probes, Life Technologies | T-3166 | |
| CNQX disodium salt | Sigma-Aldrich | C-239 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
