Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Summary

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada kırmızı floresan boya FM 4-64 etiketli veziküller presinaptik hipokampal nöron kültürlerinde vezikül serbest hızını ölçmek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır.

Abstract

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada FM boya ile etiketlenmiş veziküller presinaptik vezikül bırakma oranı izlemek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır. FM4-64 endositoz uyarılmış olarak sinaptik veziküllerin membranlar içine gömer kırmızı floresan amfifilik styryl boya. Lipofilik etkileşimleri boya büyük veziküller ve nominal bir ekstrasellüler sıvı ile ilişkili böylece parlak bir sinyal yayan floresan artışa neden olur. Yıkama adım, plazma zarı içinde dış boya kaldırmanıza yardımcı kullanıldıktan sonra, kalan FM veziküller içinde yoğunlaşmıştır ve ekzositoz, elektrik stimülasyonu başka bir yuvarlak ile indüklenen zaman sonra atılır. Floresans ortaya çıkan düşüşten vezikül serbest oranı ölçülür. FM boya geçici dış uygulanır ve olabilir bu yana, özellikle transfekte sinaps ve komşu kontrolü BOUTONS arasında oranlarını karşılaştırarak, nöronal kültürlerin ekzositoz oranlarının belirlenmesi için yararlı bir araçtır.

Protocol

Hücreler: Rat (veya fare) primer hipokampal nöron kültürleri (in vitro 14-28 gün).

Uyarım: Elektrik, iki platin elektrot ile teslim; 70-90 mV

Mikroskopi: ters bir CCD floresan mikroskop 60x petrol objektif.

Yazılım: Slidebook (Akıllı Görüntüleme Yenilikler, Santa Monica, CA)

Daha fazla ayrıntı için tamamlayıcı yöntemler sayfasına bakınız

1. Warm Hepes-tamponlu salin (HBS) oda sıcaklığında. Glutamat reseptör antagonistleri APV (50 mcM son konsantrasyon) ve CNQX (10 mcM son) ekleyin. Her FM deney genellikle 20-30 ml HBS gerektirir. 10 mcM FM 4-64 (Molecular Probes) konsantrasyonu çalışmalar için, (antagonistleri eklenmiş) HBS stok solüsyonu 1:1000 sulandırmak. Her bir deney için 2 mL FM soln olun. Çözüm ışık maruz kalmayı önlemek için folyo ile örtün.
   
   
2. Nöron içeren elektrot odasının üzerine lamel monte edin. Medya odasında odasının üst düzeyi olup olmadığını kontrol edin ve tamamen elektrotlar kapsar. Lamel altındaki herhangi bir aşırı çözüm çıkarın. Lens (bir petrol lens kullanıyorsanız) yağı ekleyin.
   
   
3. Perfüzyon aparat ayarlayın. Su, etil alkol, su, daha sonra HBS: İlk verilen sipariş (sonraki eklemeden önce iyice her biri akışını sağlar) her biri aşağıdaki birkaç mL ile durulayın. Sonraki HBS (gelecekteki adımları elle eklemek için birkaç ml kaydedin) ve perfüzyon yakın. Lamel kenarlarında ters taraftan perfüzyon çıkışı ve emme ayarlayın. Emme en üst kısmında geri kalanı nerede olarak perfüzyon çıkışı odasına ulaşırsa en iyisidir. HBS (ya perfüzyon veya elle) eklerken sağ taraftaki medya seviyesi sadece elektrotları tam kapsayan korur, böylece emiş açmak ve kendi konumunu ayarlamak.
   
   
4. Görüntü isteyen ve kabaca odak getirmeyi deneyin lamel alanı için bak. Optimal alanlarda çok sayıda sinaps içerir, ancak bireysel süreçleri ayırt edilemez hale gelir böyle çok yoğun olmamalıdır. Olmamalıdır hiç-minimal hücre gövdeleri, gereksiz membranlar (astrosit kümeleri gibi), ya da diğer nonspesifik malzemeleri (örneğin, tüy bırakmayan gibi). FM boya nonspecifically bu uygun olabilir.
   
   
5. (Yeşil ışık heyecanlandıran ve kırmızı-uzak kırmızı emisyon toplar) "WG" filtre küp kullanın. 0 (genellikle 300 900 AP'ler Bu yükleme uyaran için kullanılır) görüntü başlaması üzerine 10Hz az 900 AP sunmak için SlideView "yakalama tercihleri" ayarlayın. Görüntü penceresinde, "fluo-vis-kırmızı" filtre ayarları seçin ve maruz kalma süresi 100 ms değiştirin. Önceden varolan timelapse ayarları kapatın. Stimülasyon başlatmak için hazır olana kadar herhangi bir görüntü almayın.
   
   
6. Emme açık açık / kapalı olduğundan emin olun. Hızla emme ters sonunda odasına FM soln (2 ml) ekleyin. Hemen bir görüntü çekmek ve stimülasyon başlamak için görüntü penceresinde tamam tuşuna basın. Stimülasyon sonra 30-45 saniye bekleyin ve sonra hızlı bir şekilde yaklaşık 2 mL HBS (bir pipet yardımıyla elle Bunu yapmak için, ama bu da perfüzyon tarafından yapılabilir) ekleyerek FM yıkayın.
   
   
7. ~ 10 dakika perfüzyon yoluyla FM HBS ile yıkayın. Akış hızı 1-1.5 ml / dak olmalıdır. Bu yıkama adım sırasında, stimülasyon başlangıcında başlar, böylece uyarılması tercihlerini değiştirmek @ görüntü 10 (genellikle 900 ila 1200 AP'ler @ 10 Hz bu destaining uyaran için kullanılır). Yıkama içine 7 dk Hakkında tercihleri ​​(görüntü uyaranın başlangıcından 10), çift kontrol edin. Şimdi küçük bir odak pencereyi seçin ve subregion odağı. Stimülasyon ayarları bir sonraki adıma geçmeden önce değiştirilmiş olduğundan emin olun. Yıkama tam olup olmadığını görmek için tek bir görüntü (bireysel sinaps açıkça noktalı olmalıdır) atın. Aksi takdirde, akış oranı ek bir 0.5mL/min artış ve başka bir 2 dakika bekleyin.
   
   
8. Bir kez yıkamak tam, (genellikle 50-100 ms Pozlama süreleri arasında FM hızlı photobleaching nedeniyle minimize edilmelidir) yine de iyi ve net bir sinyal almak için gerektiği gibi pozlama süresi ayarlayabilirsiniz. Daha sonra her 5 saniyede 38 görüntü almak için timelapse tercihlerinizi ayarlayabilirsiniz. HBS başka bir 5 dakika yeterli perfüzyon kontrol edin ve perfüzyon akan bırakın. Destaining başlamak için timelapse başlayın.
   
   
9. Destain sonra, resmin 0 üzerine 1200 AP @ 10Hz (genellikle 1200 - 2000 AP'ler bu son adım için kullanılır) sunmak için stimülasyon ayarlarını değiştirmek. Timelapse ayarları kapatın ve stimülasyon başlamak için tek bir görüntü alabilir. Perfüzyon Bu adım, başlangıçtaki / "toplam açıklanmaması" floresan belirlemek için, kalan veziküler FM boya giderilmesine yardımcı olur, akıcı olmalıdır. Uyaran tamamlandıktan sonra, uyarılması ayarlarını kapatmak bölgenin odak noktası haline getirmek. Perfüzyon ve emme kapatınVe ardından son iki temel görüntüleri çekmek. Tek görüntü veya Z-yığın görüntüleri (0.5 mikron adımları) Ya alınabilir. Z-yığınlar, deney sırasında odak düzlemi bir kayma vardı durumunda yararlıdır.
   
   
10. FM deney yapılır. Hemen daha fazla deney yapıyorsanız, her deneme arasında objektif ve oda temizlenir, ancak perfüzyon cihaz son deney sonrasına kadar temizlenmesi gerekmez olmalıdır. Cihazın, daha sonra su, etanol ile tamamen durulayın.

Discussion

300 aksiyon potansiyelleri (AP), vezikül geri dönüşüm en azından bir tur, 300 AP'ler veya daha sık veziküllerin geri dönüşüm havuzu etiket verilir yükleme uyaran ikna etmek için yeterli. 900 AP'ler gibi daha yoğun yükleme uyaranlara, etiketli ek veziküllerin nominal izin verebilir rağmen, bu da daha fazla non-spesifik boyanması için boya ekstrasellüler membranlar gömebilirsiniz süreyi artırır. Ben, doğru destaining sağlamak için kritik bir yıkama adım bulduk. Genellikle 10 için akış hızı dakikada 1 - 1,5 ml + 2 dakika serpmek için önemlidir. ~ 7 dakika yıkama boya kaldırma ölçüde izlemek için tek bir görüntü alınabilir. Gerekirse, akış hızı ve yıkama süresi biraz daha artmış olabilir. Deneyler için bu hücre istirahat halindeyken bile meydana gelebilir spontan ekzositoz olayları aracılığıyla vezikül-etiketleme kaybetme olasılığını artırır olarak 10-12 dakika daha fazla devam etmek için yıkama için istenmeyen oldu. Destaining adım için, 900 ila 1200 AP'ler etiketli tüm veziküller serbest uygulandı. Ayrıca başka bir 1200 ile 2000 AP'ler genellikle destaining verileri normalleştirmek için kullanılan "açıklanmaması floresan" temel değeri elde etmek için verildi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APV	Sigma-Aldrich	A5282
FM 4-64	Molecular Probes, Life Technologies	T-3166
CNQX disodium salt	Sigma-Aldrich	C-239