Summary
Se describe la disección fina del sistema nervioso stomatogastric del estómago de la langosta americana (
Abstract
Con el objetivo de comprender cómo los sistemas nervioso produce la actividad y responder al medio ambiente, los neurocientíficos a su vez a los sistemas modelo que muestra la actividad de interés y son accesibles y susceptibles a los métodos experimentales. El sistema nervioso stomatogastric (STNS) de la langosta americana (
Protocol
Antes de comenzar con este protocolo el estómago de la langosta debe ser retirado de los animales y como se describe en el artículo del compañero Jove (Bierman y Tobin, 2009). La mayoría de los pasos que se indican a continuación se realiza bajo un microscopio de disección.
Parte I con aislamiento de los ganglios de la comisura
- Orientar el plato para que el extremo anterior (por el labio) es lejos de usted y el extremo posterior (por el píloro) es hacia usted.
- Asegúrese de que el estómago se fija de modo que quede lo más plana posible en el plato.
- Pin por el esófago a ambos lados del labio.
- Si es necesario, reorganice los otros pines colocados durante la disección bruto.
- Retire la hipodermis.
- Coge la hipodermis, cerca de la gm2/gm3 músculos, se desprenden de estos músculos y tire suavemente en la dirección anterior.
- Separar la hipodermis de la grasa subyacente cortando las conexiones. Uso cada vez mayor atención alrededor de la arteria central, que encierra una parte clave del sistema nervioso stomatogastric. Salir de la hipodermis intacto dentro de un radio de 0,5 cm del ganglio stomatogastric, que se encuentra entre los músculos GM1b.
- Cortar hipodermis separados.
- Separar el cerebro del tejido subyacente.
- Identificar a los dos grandes nervios comisurales que el proyecto bilateral de la parte anterior del cerebro de los ganglios de la comisura de la parte anterior del estómago.
- Dejar intactos estos nervios, levante suavemente el cerebro con una pinza y se corta a separar el cerebro del resto de los tejidos. Tenga cuidado al hacer esto, como el nervio stomatogastric se encuentra debajo del cerebro y se debe mantener intacta.
- Aparte de los ganglios de la comisura de los alrededores de los tejidos.
- Siga uno de los nervios comisurales a uno de los ganglios de la comisura.
- Identificar los iones y su hijo - estos nervios deben permanecer intactos. El ganglio comisural tendrá muchos nervios que irradian. Cortar la mayoría de ellos (excepto el ion e hijo), pero deja un nervio adicional adjunta para mantener el ganglio comisural en su lugar mientras usted termina la disección.
- Repita con el ganglio comisural otros.
- Limpie el ion y el hijo de lateral a medial. Deja intacto el nervio vestibular para anclar el sistema nervioso en el estómago. El ganglio del esófago se sienta fueron los iones s se cruzan. Usted puede limpiar debajo de ella tomando el nervio inferior del ventrículo y tirando hacia arriba para cortar por debajo.
Parte II-El aislamiento del ganglio Stomatogastric (STG) y los nervios restantes.
- Separar el STG de alrededor del tejido.
- El STG se encuentra dentro de una arteria que discurre entre los músculos GM1b y hasta el gm2a, b músculos. Busque el extremo del corte de la arteria cerca de la gm2a, b músculos.
- Tire del extremo del corte de la arteria y la parte anterior, para exponer la DVN. Continuar tirando hacia arriba hasta llegar al nivel de la hipodermis restantes. Una vez separados, la arteria se puede recortar el nivel en el que toca la hipodermis restantes.
- Cortar el colgajo del músculo que se encuentra en la tribuna de la langosta.
- Levante la hipodermis encima de la arteria, al observar que la arteria que hace un túnel dentro de la grasa por encima de la STG. Ponga una hoja de las tijeras dentro de la arteria y corte el músculo por encima de ella. Compruebe que puede ver el dvn como se corta para estar seguro de que esté seguro, por encima de la STG. Continuar el corte anterior, a raíz de la arteria. Como se corta por encima de la STG, usted será capaz de ver la stn que emana la parte anterior de la STG y abajo de buceo en el músculo. Continuar el corte anterior de separar totalmente el músculo por encima del STG.
- Borrar cualquier tejido fuera de la STN.
- Separar el s agn del tejido circundante. (Incluso si usted no va a grabar de la AGN, se necesita una parte del nervio intacto de precisar el ganglio de registros intracelulares.)
- Para ver mejor el s agn, retire el resto de la hipodermis y una capa fina de los músculos subyacentes.
- Sólo por detrás de la STG, identificar a un túnel oscuro en el tejido adiposo y el músculo en cada lado de la DVN.
- Palo una hoja de tijera en el interior del túnel y cortar el tejido sobre el nervio. Continuar el corte lateral, siguiendo el nervio, para aislarlo. (Un par de milímetros es suficiente para que fijando el ganglio, pero exponer al menos 5 mm de la AGN si va a grabar de ella.)
- Separe la AGN de los músculos que inerva mediante la reducción de las conexiones.
- Repetir en el otro lado para aislar el agn otros.
- Una vez que ambos s AGN han sido disecados, cortar todos los músculos y el tejido que conecta el STG con el estómago.
- Aislar el s. mvn Son un par bilateral de los nervios pequeños se ramifican los LVN y atraviesa lateralmente por debajo de la grasa.
- O bien utilizar tijeras o pinzas de dos a cortar la grasa en un lado de la DVN, cerca de donde se bifurca en el s. dos LVN Aquí están lejos de la s mvn y no correrá el riesgo de cortarlos.
- Levante la capa de grasa, e identificar la parte de abajo mvn pequeños. Estos nervios corren por dentro de lateral justo por detrás del nivel de los músculos GM1b.
- Eliminar la capa de grasa por encima de la mvn, dejando el nervio intacto, por ahora lo que no se enrede. Que reducirá su extremo lateral de sobre el estómago, al final de la disección.
- Repita el proceso en el otro lado para aislar el mvn otros.
- Aislar el s LVN y los nervios posteriores.
- A partir de la rama donde lvn s lateralmente fuera de la DVN, siga una LVN cortando la grasa por encima de ella. Dependiendo de la preparación, a veces toda la capa de grasa sobre el nervio se puede quitar.
- Siguen revelando el LVN hasta el punto donde las ramas de PSN.
- Aislar el PYN.
- Localice el PYN, es un nervio que viajan atrás en el píloro.
- Quitar la membrana delgada que cubre la región.
- Aislar el PYN cortando una pequeña sección del píloro, que se adjunta a la PYN.
- Levante con cuidado la sección pilórica y cortar el tejido en ambos lados de la PYN hasta llegar a la rama que se conecta al PDN.
- Aislar el PDN.
- Localice el PDN, que es un nervio que viajan atrás en el músculo dilatador del píloro.
- Cortar una pequeña sección del músculo dilatador del píloro, que se adjunta al NPD.
- Levante con cuidado la sección del músculo dilatador del píloro, cortar el tejido en ambos lados de la PDN, hasta llegar a la rama que se une a la PYN.
- Aislar el LVN ventral, que conecta el PYN y PDN, el LVN.
- En el punto de poder triangular donde el PDN PYN y conectar con el LVN ventral, aislar cualquier pequeña sección del nervio que sale de la LVN ventral, como el vpln. Este será utilizado como un identificador para tirar de la LVN ventral.
- Levante el mango y cortar el tejido en ambos lados de la LVN ventral, trabajando en la dirección anterior hasta llegar al punto donde las ramas de PSN.
- Repita los pasos 10 a 13 para aislar los nervios LVN y posterior en el otro lado.
- Separe el sistema nervioso stomatogastric del estómago.
- Para separar totalmente el LVN del estómago, tire de la psn y cortar todos los tejidos y nervios conectados a los LVN y LVN ventral, a excepción de la PDN y PYN. Repita este proceso en el otro lado.
- Corte el extremo lateral de cada mvn. Levante el extremo lateral y cortar los archivos adjuntos extraños entre el nervio y el tejido del estómago subyacente.
- En el extremo anterior, cortar los archivos adjuntos extraños a los ganglios de la comisura, y el corte del nervio vestibular de cada lado.
- Visualmente escanear el sistema stomatogastric sistema nervioso para identificar y luego cortar los archivos adjuntos adicionales a los tejidos del estómago.
- Agarrar el extremo anterior de ambos nervios comisurales, por encima de los ganglios de la comisura, y la cáscara del sistema nervioso stomatogastric fuera el estómago y moverlo a un lado del plato. Al hacer esto, cortar los archivos adjuntos restantes para liberar el sistema nervioso.
- Preparar el plato Sylgard pequeños.
- Aplicar un poco de tejido del estómago a fondo en la superficie de la Sylgard en el plato pequeño. Esto va a disminuir la hidrofobicidad de la Sylgard, por lo que la solución salina se distribuyen uniformemente a través de la antena.
- Enjuagar y llenar el recipiente con solución salina refrigerada Sylgard.
- Transferir el sistema nervioso para el plato Sylgard preparado por el acaparamiento de los extremos anteriores de los nervios comisurales, el levantamiento del sistema nervioso del plato grande, y por la que en el plato pequeño.
- Pin de la STNS en el plato pequeño con una combinación de los pines minuten y delgado pines corte de alambre de tungsteno.
- Asegúrese de que la preparación es la parte dorsal por la comprobación de que el nervio inferior del ventrículo está en dirección opuesta a la Sylgard.
- Quitar el cerebro y el pin de los nervios comisurales.
- Tire suavemente del sistema nervioso apretados y planos, tirando cada una de las s psn posterior y lateral, y la fijación hacia abajo.
- Quitar el músculo dilatador del píloro del PDN, s, y el pin s. PDN
- Quite elsegmento pilórica del PYN s, y el pin s. PYN
- Precisar los nervios que quedan aislados, como los nervios labial, el s mvn y s. agn
- Desheath el STG.
- Asegúrese de que el STG es plana contra la Sylgard y mantiene tensa por el lateral s agn, la anterior y la stn dvn posterior.
- Organizar la iluminación para permitir la visualización de los axones en el DVN.
- Utilizando una aguja pequeña aguja de tungsteno o bien, hacer un pequeño agujero poco profundo en la vaina que rodea el DVN, justo por detrás del STG.
- Saque la aguja a través de la DVN, dorsal a los axones, la creación de un desgarro horizontal en la vaina del nervio.
- Agarrar la solapa de la vaina del nervio posterior a la STG y tire hacia delante para retirar la cubierta de la cara dorsal de la STG.
| Abreviaturas: | |
| STNS | Sistema nervioso Stomatogastric |
| STG | Ganglio Stomatogastric |
| COG | Ganglio comisural |
| stn | nervio stomatogastric |
| mvn | nervio medial ventricular |
| ion | los nervios del esófago inferior |
| hijo | los nervios del esófago superior, |
| agn | nervio gástrico anterior |
| dvn | nervio dorsal del ventrículo |
| LVN | nervio lateral del ventrículo |
| psn | los nervios del estómago posterior |
| vpln | ventral del nervio lateral posterior |
| PYN | nervio pilórica |
| PDN | nervio dilatador pilórica |
Discussion
La anatomía de la langosta y el estómago STNS ha sido bien descrita previamente 5,6, y las variaciones de este procedimiento la disección se han utilizado en numerosos estudios. Se recomienda familiarizarse con la anatomía del estómago 5-7 y STNS 5,8 antes de la disección de inicio. Esa familiaridad hace que disminuya el riesgo de daños accidentales sufridos por los nervios y los tejidos.
Para mantener la salud de la preparación, es fundamental para mantener la preparación a una temperatura fresca. Esto se logra fácilmente mediante el intercambio de la solución salina cada 30 minutos con solución salina a 4 ˚ C conservarse en la nevera. Cuando se sumerge en una solución salina fría, el aislamiento de preparación STNS es viable por muchas horas. Grabaciones en relación Homarus gammarus han demostrado una actividad rítmica estable desde el STG lo largo de 5 días in vitro 9; robustez similar se ha visto en el H. americanus (obs. pers.).
Modulador de entrada a la STG de los ganglios de la comisura es necesario para preservar los patrones motores en marcha. Por lo tanto, para mantener una actividad normal rítmica estos ganglios y el hijo de iones, y los nervios STN deben mantenerse intactos. La disección se describe conserva varios nervios motores (que contiene los axones de la neurona motora): el s AGN (con molino gástrico (GM) axones), el mvn s (que contiene lateral gástrico (LG) e Inferior axones cardiaca (IC)), el s PYN (que contiene las neuronas pilórica (PY) axones), el PDN s (que contiene Dilatador pilórica (PD) axones), y la s LVN (que contiene pilórica lateral (LP), gástrico medial (MG), los axones de GLP, así como los de GM, PD y PA). Mediante la disección de más (o diferente) los nervios, otros axones de neuronas motoras pueden ser grabadas. Cada tipo individual de la neurona motora axonal puede registrarse de forma individual mediante la disección y el registro de los nervios que inervan los músculos a los que ese tipo de proyectos de las neuronas.
Esta preparación se puede utilizar para una variedad de estudios se centraron en la función del sistema nervioso. La actividad de las neuronas podrán ser grabadas con registros intracelulares, el electrodo afilado de somata o axones, o mediante el registro de los impulsos eléctricos extracelular de los nervios. Muchos canales de iones en las neuronas STG han sido parcialmente clonado y el ARNm se puede medir de forma manual sacó somata 10,11.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a nuestro asesor, el Dr. Eva Marder. Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Salud subvenciones NS17813 a Eva Marder y NS059255 a AE T.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Tool | California Fine Wire Company | Cut into 1-2mm pieces to use as fine pins. | |
| Forceps #5 | Tool | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Tool | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Tool | Fine Science Tools | 15370-52 | These are the top of the line. There are more economical spring scissors available from the same company. |
| Petri Dish (100x15mm) | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | Fill 2-4mm with Sylgard 182. |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26018-17 | Optional. Desheathing can be done with scissors and fine forceps alone. |
| Super fine forceps #5SF | Tool | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Tungsten Needles | Tool | Fine Science Tools | 10130-05 | Optional. Desheathing can be done with scissors or with pins cut from fine tungsten wire. |
| Dissection microscope |
References
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