Summary
Мы описываем штраф рассечение стоматогастральных нервной системы из желудка американский омар (
Abstract
С целью понимания того, как нервная система производит деятельность и реагировать на окружающую среду, неврологи обратиться к модельных систем, которые проявляют активность интерес и являются доступными и поддаются экспериментальных методов. Стоматогастральных нервной системы (ст.) американского омара (
Protocol
До начала этого протокола желудке омара должны быть удалены из животных и получают, как описано в статье спутником Юпитера (Бирман и Тобина, 2009). Большинство шаги, описанные ниже, должны быть выполнены при вскрытии микроскопом.
Часть I-Изоляция спаечный Ganglia
- Восток блюдо так, чтобы передний конец (на губы) находится далеко от вас и задний конец (по привратника) является по отношению к вам.
- Убедитесь, что желудок закреплен так, что она лежит плоская, как можно на блюдо.
- Pin вниз по пищеводу с каждой стороны губы.
- При необходимости, переставить другие выводы, сделанный во время валовой рассечение.
- Удалить гиподермы.
- Захватите гиподермы возле gm2/gm3 мышц, отделить ее от этих мышц и осторожно потяните в переднем направлении.
- Отдельные гиподермы от основной жир Ножницы любые соединения. Используйте увеличился уход вокруг центральной артерии, которая охватывает ключевой частью стоматогастральных нервной системы. Оставьте гиподермы нетронутым в течение примерно 0,5 см, радиус стоматогастральных ганглия, который находится между gm1b мышц.
- Отрежьте разделенных гиподермы.
- Отключите мозг от подлежащих тканей.
- Определите два больших спаечный нервы, что проект двусторонней из передней части мозга спаечный ганглиев в передней части живота.
- Оставляя эти нервы повреждены, осторожно поднимите мозга пинцетом и разрезается с целью разделения мозга от остальной ткани. Будьте осторожны, как вы делаете это, как стоматогастральных нерва под мозга и должны быть сохранены.
- Отдельные спаечный ганглиев от окружающих тканей.
- Выполните одно спаечный нервы одному из спаечный ганглиев.
- Определение ионов и сын - эти нервы должны оставаться нетронутыми. Спаечный ганглия будет много нервов лучами. Вырезать большинство из них (за исключением ионов и сын), но оставить один дополнительный нерв прилагается провести спаечный ганглия на месте, пока вы закончите рассечение.
- Повторите с другой спаечный ганглия.
- Чистая ионов и сын от бокового к медиальному. Оставьте губной нерв нетронутыми на якорь нервной системы в желудок. Пищевода ганглия сидит были ион с пересекаются. Вы можете очистить под ним, захватывая уступает нерва желудочка и подтягивание резать снизу.
Часть II-Изоляция стоматогастральных ганглия (STG), а остальные нервы.
- Отдельные STG от окружающих тканей.
- STG сидит внутри артерии, которая проходит между gm1b мышцы и до gm2a, б мышц. Посмотрите на срез артерии возле gm2a, мышцы б.
- Вытяните обрезанный конец артерии и кпереди, разоблачить DVN. Продолжить потянув вверх, пока не достигнете уровня оставшихся гиподермы. После отделения, артерии может быть урезан до уровня, когда она касается оставшихся гиподермы.
- Отрежьте мышцу лоскут, который был расположен в трибуны омаров.
- Поднимите гиподермы выше артерии, отметив, что артерии делает туннель внутри жира, расположенного над STG. Положите одну лезвие ножниц вашей внутренней артерии и сокращение мышц над ним. Убедитесь, что вы можете видеть DVN, как бы Вы, чтобы убедиться, что Вы благополучно выше СТГ. Продолжить резки вперед, следуя артерии. Как вы голову выше СТГ, вы будете иметь возможность видеть STN исходящие спереди от СТГ и дайвинг вниз, в мышцы. Продолжить резки вперед, чтобы полностью отдельных мышц выше СТГ.
- Удалите все ткани от станции.
- Отдельные СМВП с от окружающих тканей. (Даже если вы не планируете запись с AGN, вам придется часть нетронутыми нервы придавить ганглия для внутриклеточных записей.)
- Чтобы лучше понять СМВП с, удалить оставшиеся подкожную клетчатку, и тонкий слой основной мышцы.
- Просто сзади STG, определить темный туннель в жировой и мышечной по обе стороны от DVN.
- Придерживайтесь один ножниц лезвия внутри туннеля и сократить ткани выше нерва. Продолжить резки с боков, после нерва, чтобы изолировать его. (Пару миллиметров достаточно для закрепления ганглия, но выставить не менее 5 мм в СМВП, если вы планируете записывать от него.)
- Отсоедините СМВП от мышц она иннервирует за счет сокращения связей.
- Повторите с другой стороны, чтобы изолировать других СМВП.
- Как только оба СМВП ы были рассеченные, сократить все мышцы и ткани подключения STG в желудок.
- Изолировать MVN s. Они двусторонних пару маленьких нервы отходящие ЛВН и пересечения с боков под жиром.
- Либо использовать ножницы или два пинцета, чтобы прорваться через жира на одной стороне DVN, недалеко от места ее филиалов в два ЛВН s. Здесь вы далеко от с MVN и не рискнет сокращая их.
- Поднимите жировой слой, и определить небольшое под MVN. Эти нервы запустить медиальнее сбоку только заднюю до уровня gm1b мышц.
- Удалить слой жира, расположенного над MVN, оставляя нетронутыми нервы на данный момент, чтобы он не станет запутанным. Вы будете вырезать его боковой конца из отходящих желудка в конце рассечение.
- Повторите процедуру с другой стороны, чтобы изолировать других MVN.
- Изолировать ЛВН с и задние нервы.
- Начиная где филиал ЛВН с боков от DVN, следуйте ЛВН за счет сокращения жира, расположенного над ним. В зависимости от подготовки, иногда весь жировой слой выше нерва может быть снял.
- Продолжить выявление ЛВН до точки, где PSN ветки.
- Изолировать pyn.
- Найдите pyn, это нерв путешествия сзади за привратника.
- Удалить тонкую мембрану покрытие этого региона.
- Изолировать pyn за счет сокращения небольшая часть привратника, прикрепленный к pyn.
- Аккуратно поднимите пилорического раздел и отрезать ткани по обе стороны от pyn пока не дойдете до филиала, который крепится к ПДН.
- Изолировать ПДН.
- Найдите ПДН, это нерв путешествие назад к пилорического мышц расширитель.
- Вырезать небольшой участок мышцы пилорического расширитель, прикрепленный к ПДН.
- Аккуратно поднимите пилорического разделе мышц расширитель, срежьте ткань с обеих сторон ПДН, пока не достигнете филиал, который крепится к pyn.
- Изолировать вентральной ЛВН, который соединяет pyn и ПДН к ЛВН.
- На треугольные точки ветвления, где pyn и ПДН подключиться к вентральной ЛВН, изолировать какую-либо небольшую часть нерва, которая ответвляется вентральной ЛВН, таких как vpln. Это будет использоваться в качестве ручки тянуть на брюшной ЛВН.
- Поднимите на ручке и отрезать ткани по обе стороны вентральной ЛВН, работающих в переднем направлении, пока не дойдете до точки, где PSN ветки.
- Повторите шаги 10 - 13, чтобы изолировать ЛВН и задней нервы на другой стороне.
- Отсоедините стоматогастральных нервной системы из желудка.
- Чтобы полностью отсоединить ЛВН из желудка, наденьте на PSN и вырезать все ткани и нервы придает ЛВН и брюшной ЛВН, за исключением ПДН и pyn. Повторите эту процедуру на другой стороне.
- Отрежьте боковые конце каждого MVN. Поднимите боковые конца и разрежьте посторонних вложений между нервом и подлежащих тканей желудка.
- На переднем конце, разрезать любые посторонние вложения в спаечный ганглиях, а также сокращение губной нерв с каждой стороны.
- Визуально сканирования стоматогастральных нервной системы системы для выявления и затем вырезать любые дополнительные вложения в желудке ткани.
- Захватите на переднем конце и спаечный нервы, прежде спаечный ганглиев, и кожица стоматогастральных нервной системы от желудка и переместить его в сторону тарелки. Когда вы это делаете, вырезать любые оставшиеся вложений свободных нервной системы.
- Подготовьте небольшое блюдо Sylgard.
- Руб некоторых тканей желудка полностью на поверхности Sylgard в небольшое блюдо. Это позволит сократить гидрофобности Sylgard, так что солевой будет распределять равномерно по блюду.
- Промойте и заполните Sylgard блюдо с охлажденным раствором.
- Передача нервной системы приготовленное блюдо Sylgard, захватывая передние концы обеих спаечный нервы, поднимая нервной системы из большого блюда, и, положив его в небольшое блюдо.
- Pin ст. в небольшое блюдо, используя комбинацию контактов Minuten и тоньше, контакты, вырезанные из вольфрамовой проволоки.
- Убедитесь, что подготовка спинной стороной вверх, проверяя, что уступает нерва желудочка направлен от Sylgard.
- Удалить мозга и контактный спаечный нервы.
- Осторожно потяните нервной системы жесткой и плоской, потянув каждый из PSN, а сзади и с боков, и закрепление их.
- Удалить пилорического мышц расширитель из ПДН с, и пин-код ПДН s.
- Удалитьпилорического сегмент от pyn с, и пин-код pyn s.
- Pin уничтожить любые оставшиеся изолированные нервы, таких как губные нервы, MVN с и СМВП s.
- Desheath STG.
- Обеспечить STG плоская против Sylgard и провел тугой на боковой СМВП с, STN передней и задней DVN.
- Организовать освещение, чтобы включить визуализацию аксонов в DVN.
- С помощью небольшой булавкой или тонкой иглой вольфрама, сделать небольшое отверстие в мелкой оболочки окружающего DVN, только сзади STG.
- Вытяните иглу через DVN, от спины к аксонов, чтобы создать горизонтальную слезу в нервных оболочки.
- Берем лоскут нервных оболочки задней к СТГ и потяните вперед для удаления оболочки от спинной стороны СТГ.
| Сокращения: | |
| Ст. | Стоматогастральных нервной системы |
| STG | Стоматогастральных ганглии |
| CoG | Спаечный ганглии |
| STN | стоматогастральных нерва |
| MVN | медиальный нерв желудочка |
| ион | уступает пищевода нерва |
| сын | превосходное пищевода нерва |
| AGN | передние желудочные нервы |
| DVN | спинной нерв желудочка |
| ЛВН | бокового желудочка нерва |
| PSN | задний нерв желудка |
| vpln | вентральной задних боковых нервов |
| pyn | пилорического нерва |
| PDN | пилорического нерва расширитель |
Discussion
Анатомия желудка омаров и ст. была хорошо описана ранее 5,6, и вариации этой процедуры вскрытия были использованы в многочисленных исследованиях. Мы рекомендуем ознакомления с анатомией желудке 5-7 и 5,8 ст. до начала вскрытия. Такое знакомство приведет к снижению риска случайного повреждения нервов и тканей.
Для поддержания здоровья подготовки, очень важно для поддержания препарата при прохладной температуре. Это легко достигается путем обмена солевой каждые 30 минут с 4 ˚ C солевой хранить в холодильнике. При погружении в холодную физиологическим раствором, изолированных подготовки ст. является жизнеспособным в течение многих часов. Записи в смежных гаммарус Homarus продемонстрировали стабильный ритмической активности СТГ на протяжении 5 дней в пробирке 9; аналогичные надежности был замечен в H. атепсапиз (чел. набл.).
Модуляторных вклад в STG от спаечный ганглиев требуется сохранить текущие модели двигателя. Поэтому для поддержания нормальной ритмической активности этих ганглиев и ионов, сын, и STN нервы должны быть сохранены. Рассечение мы опишем несколько сохраняет нервы двигателя (содержащих аксонов двигательных нейронов): AGN с (содержащие желудка Милль (GM) аксонов), MVN с (содержащие Боковые желудка (LG) и Нижний Сердечная (IC) аксонов), pyn с (содержащий пилорического нейрона (PY) аксонов), ПДН с (содержащие пилорического Расширитель (PD) аксонов), а ЛВН с (содержащие Боковые пилорического (LP), медиальная желудка (МГ), сжиженный нефтяной газ аксонов, а также от GM, П. Д. и П.). По вскрытии дополнительный (или другой) нервов, других двигательных нейронов аксоны могут быть записаны. Каждый отдельный тип аксонов двигательных нейронов могут быть записаны в отдельности анализируя и записи с нерва, иннервирующих мышцы, к которым типа проектов нейрона.
Этот препарат может быть использован для различных исследований сосредоточена на функции нервной системы. Активность нейронов может быть записан либо с помощью внутриклеточных, острые записи электрода от somata или аксонов, или путем регистрации электрических импульсов внеклеточно от нервов. Многие ионные каналы в нейронах STG были частично клонированы и мРНК может быть измерена с вручную вытащил somata 10,11.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить нашего консультанта, доктора Евы Мардер. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения грантов NS17813 Еве Мардер и NS059255 А. Е. Т.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Tool | California Fine Wire Company | Cut into 1-2mm pieces to use as fine pins. | |
| Forceps #5 | Tool | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Tool | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Tool | Fine Science Tools | 15370-52 | These are the top of the line. There are more economical spring scissors available from the same company. |
| Petri Dish (100x15mm) | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | Fill 2-4mm with Sylgard 182. |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26018-17 | Optional. Desheathing can be done with scissors and fine forceps alone. |
| Super fine forceps #5SF | Tool | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Tungsten Needles | Tool | Fine Science Tools | 10130-05 | Optional. Desheathing can be done with scissors or with pins cut from fine tungsten wire. |
| Dissection microscope |
References
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).
- Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature. 417, 343-350 (2002).
- Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen. J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).
- Bierman, H. S., Tobin, A. E. Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus. J Vis Exp. 27, (2009).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).
- Herrick, F. H. Natural history of the American lobster. Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion. J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).
- Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture. J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).
- Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals. Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).
- Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).
