Summary
I artikeln beskrivs ett nytt protokoll och reagens som utformats för känslig mätning av neurotoxiska effekter av föreningar och behandlingar på co-kulturer av nervceller och astrocyter med högt innehåll analys. Resultaten visar att höga innehållsanalys är en spännande ny teknik för neurotoxicitet bedömning.
Abstract
Hög halt Analys (HCA) analyser kombinera celler och reagenser detektion med automatiserad bildbehandling och kraftfull bild algoritmer analys, vilket gör att mätning av flera cellulära fenotyper inom en och samma analys. I denna studie utnyttjas vi HCA för att utveckla en ny analys för neurotoxicitet. Neurotoxicitet bedömning utgör en viktig del av drog säkerhetsbedömning, samt vara ett betydande fokus på miljöskydd insatser. Dessutom är neurotoxicitet också ett väl godkänt
Protocol
Cellberedningen:
- Innan cell seedning för analys, kultur nervceller / astrocyter i tillväxt media tills ~ 70-80% konfluenta (såvida cell sådd direkt från tö eller isolering).
- Ta loss celler från kultur flaskor / plattor via metoden lämplig för celltyp av intresse. Om det behövs för att bestryka analys tallrik brunnar med poly-D-lysin eller extracellulärt matrix protein ökar cell adhesion. Co-kulturer av astrocyter och nervceller kan seedas samtidigt eller efter varandra. För sekventiell seedings är plätering av astrocyter först som en "basala" lager, följt av neuronala plätering och differentiering, om det behövs. Justera celltäthet som är lämpligt för celltyp, efterföljande kultur tiden parametrar av intresse, etc. Beroende på kultur ålder, cell-källa och sådd densitet, kan primärkulturer varierar mycket i graden av spridning, GFAP uttryck eller neurite utväxt - det är viktigt att karaktärisera och optimera din cell för att ge den mest biologisk relevans för din experimentell modell, samt att föreskriva effektiva bildbehandling, segmentering och analys med hjälp av HCS (se figur 1). Efter att ha lagt celler till tallriken (celler kan seedas i 90 mikroliter media, för att underlätta toxin behandling som beskrivs i steg 3 nedan), låt plattan att sitta på en plan yta i rumstemperatur i 15-30 min, vilket möjliggör ännu cell distribution. Efter denna period, inkubera celler i tillväxt media (37 ° C / 5% CO 2) i minst 24 timmar, byt sedan till villkor differentiering kultur (t ex låga serum / NGF för PC12 celler), som är lämpligt. Fortsätt kultur tills cellerna når önskad nivå av sammanflödet eller differentiering, byte av media med jämna mellanrum lämpliga för celltyp.
- Cell behandlingar (kontroll föreningar, testa föreningar, etc.) kan införas när som helst under denna kultur period, som är lämpligt för tid-behandling av intresse. Akrylamid, väteperoxid och K-252a finns som neurotoxiska kontroll föreningar. Tillräckligt med reagens finns för dubbla 12-punkters kurvor dosrespons (inklusive en dH 2 O eller DMSO-kontroll som i dos-respons) för alla fem plattor med 96 brunnar. De föreningar som finns längst 250X koncentration (för K-252a, förutsatt att en maximal behandling av 1 mikrometer) eller 10X (för akrylamid och väteperoxid utgående från maximal behandling av 100 mm och 10 mm, respektive). Rekommenderad behandling förberedelse innebär halv-log (1: √ 10) seriell utspädning av 250X substansen i DMSO, följt av utspädning i Compound spädningsbuffert till 10X (10X kontroll föreningar med ursprung i dH 2 O kan serie spädas direkt i sterila dH 2 O eller sammansatt spädningsbuffert). 10 mikroliter av varje behandling kan sedan läggas till de 90 mikroliter av kultur medier som redan finns i varje brunn, till en slutlig 1X koncentration (0,4% DMSO eller 10% dH 2 O). Exempel på uppgifter finns för 24 eller 96 timmars förening behandling vid 37 ° C före fixering.
Cell fixering och immunofluorescens färgning:
Notera: Färgning tid är ~ 2,5 timmar efter fixering. Låt inte brunnarna torka ut mellan färgning steg. Aspiration och dispens av reagens bör utföras vid låga flöden minska de celler förlust på grund av vätska skjuvning. Alla rekommenderade "per brunn" volymer hänvisa till en enda väl en mikroplatta med 96 brunnar. Alla rekommenderade "per 96-brunnar" Volymerna innehåller 25% mer än för vätskehantering volym förlust. Alla färgning steg utföras vid rumstemperatur (RT). Alla buffertar och lösningar antikroppar är stabila under minst 24 timmar vid RT.
- I slutet av kultur perioden förvärma HCS Fixation Solution (2X) till rumstemperatur (RT) eller 37 º C om så önskas (12 mL/96-well plåt). I en kemisk dragskåp, tillsätt 100 mikroliter / brunn direkt till kultur medier och låt fix för 30 min vid RT. Ta bort fixativ / toxin som innehåller media och sophantering i överensstämmelse med reglerna för farligt avfall (se MSDS). Om förfarandet omedelbart färgning, skölj varje brunn två gånger med 200 mikroliter av HCS Immunofluorescens Buffer. Alternativt, om plattorna ska färgas vid ett senare tillfälle, skölj två gånger med 200 mikroliter tvättbuffert, sedan lämna second skölj volym i brunnar och plattor lagra tätt tillsluten vid 4 ° C tills färgning.
- Om fasta prover har förvarats vid 4 ° C innan färgning, skölj två gånger med 200 mikroliter HCS Immunofluorescens buffert innan du fortsätter med färgningsprotokollet.
- Förbered brukslösning av kanin anti-βIII tubulin / mus Anti-GFAP HCS primära antikroppar (6 mL/96-well platta) som följer: Tillsätt 60 mikroliter av varje tinas primär antikropp till 5,88 ml HCS Immunofluorescens Buffer. Blanda väl. Ta bort tidigare Immunfluorescens Buffer skölj. Tillsätt 50 mikroliter av primär antikropp lösning till varje brunn och inkubera i 1 timme vid RT.
- Ta bort primär antikropplösning. Skölj tre gånger med 200 mikroliter HCS Immunofluorescens buffert.
- Förbered brukslösning av HCS sekundär antikropp / Hoechst HCS Nuclear Stain (6 mL/96-well plåt) på följande sätt: Tillsätt 30 mikroliter av varje tinas sekundär antikropp och 30 mikroliter av den upptinade Hoechst HCS Nuclear Stain till 5,91 ml HCS Immunofluorescens Buffer. Blanda väl, skydda lösning från ljus. Ta bort tidigare HCS Immunofluorescens Buffer skölj. Tillsätt 50 mikroliter av HCS sekundär antikropp / Hoechst HCS Nuclear Stain lösning och inkubera i 1 timme vid RT, skyddat från ljus.
- Ta bort HCS sekundär antikropp / Hoechst HCS Nuclear Stain lösning. Skölj två gånger med 200 mikroliter HCS Immunofluorescens buffert.
- Ta bort tidigare HCS Immunofluorescens Buffer skölj. Skölj två gånger med 200 mikroliter av HCS tvättbuffert, lämnar second skölj volym i brunnar.
- Seal platta och bild direkt, eller förvara plattan vid 4 º C, skyddat från ljus tills klar för avbildning.
Bild och analys:
- Avbildning och analys av färgade plattor kan utföras på en mängd tillgänglig HCS plattformar, bland annat i cell Analyzer (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Scientific) eller Opera (Perkin Elmer). Några riktlinjer för avbildning och analys finns i tabell 1:
| HCS222 Image Acquisition riktlinjer | |||
| Upptäckt Reagens | Objektiv | Excitation Filtrera Range [topp / bandbredd (nm)] | Emission Filtrera Range [topp / bandbredd (nm)] |
| Hoechst HCS Nuclear Stain | 20X | 360/40 | 460/40 (eller 535/50 om nödvändigt) |
| HCS sekundär antikropp, FITC-Donkey anti-kanin IgG | 20X | 480/40 | 535/50 |
| HCS sekundär antikropp, Cy3-Donkey anti-mus IgG | 20X | 535/50 | 600/50 |
HCS222 bildanalys riktlinjer | |||
| Cell Parameter | Detection | Segmentering / Mätning | Logisk |
| Mobilnummer, Nuclear egenskaper | Hoechst HCS Nuclear Stain | Nukleära området (460 nm utsläpp kanal). Räkna antalet kärnor. DNA-innehåll (kärnkraft intensitet) eller nukleära analyser område är också möjliga. | Använd mobilnummer, nukleära egenskaper för att bestämma cellens förlust, toxicitet fenotyper, etc. Kan "filter" kärnor för de som är förknippade med βIII-tubulin eller GFAP uttryck för att få separata neuronal och astrocytic celler / karakteriseringar (rekommenderas starkt). |
| βIII-tubulin Expression, Neurite utväxt | HCS sekundär antikropp, FITC-konjugerat | Cytoplasmiska regionen (535 nm utsläpp kanal). FITC-signal kan användas för att skilja neuronal cell organ från neurites (t.ex. via minimum / genomsnittlig cellkroppen områden, minimum / maximum längd neurite och bredder). Bestäm parametrar såsom total neurite längd, neurite räknas / cell, etc. | Neurite utväxt mätningar kan anpassas under neuronal differentiering eller som en följd av kemiska skador, sjukdomstillstånd, etc. Kan "filter" cell organ för de som förknippas med βIII-tubulin uttryck för att erhålla olika neuronala karakterisering (rekommenderas starkt). |
| GFAP Expression, astrocyternas område | HCS sekundär antikropp, Cy3-konjugerade | Cytoplasmiska regionen (600 nm utsläpp kanal). Cy3 signalen kan användas för att definiera astrocytic cytoplasmisk segmentering. Bestäm parametrar som genomsnittet cytoplasmatiska signalstyrka, cell-området, etc. | GFAP uttryck och astrocyternas cell område kan anpassas under astrocyternas utveckling eller som ett resultat av kemiska skador, sjukdomstillstånd, etc. "filter" cell organ för de som förknippas med GFAP uttryck för att få olika astrocytic karakterisering (rekommenderas starkt). |
. Tabell 1 Image Acquisition och analys Riktlinjer - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-kultur) analys
Representativa resultat:
Figur 1. βIII-tubulin och GFAP immunofluorescence av blandade råtta neurala cellkulturer.
Co-kulturer av primära råtta hippocampus astrocyter med antingen primära råtta hippocampus nervceller eller råtta PC12 cellerna som genereras av förhandsfinansieringen bordläggning astrocyter i flera dagar i kulturen, följt av neuronala sådd. Primär nervceller odlades i ytterligare 11 dagar, medan PC12s odlades i ytterligare två dagar under differentiering förhållanden (låg serum / NGF). Cell hantering, fixering och immunfärgning utfördes enligt HCS222 analys protokoll. Celler var avbildade på GE i Cell Analyzer 1000 (3,3) på 20X (primära neuroner) eller 10X (PC12) objektiv förstoring och analyseras i Cell Analyzer 1000 Workstation (3,4) Neurite utväxt och Multi Target algoritmer Analys med hjälp av GE övre panelen.: smält bilder av Hoechst HCS Nuclear Stain (blå), βIII-tubulin (grön) och GFAP (röd) fluorescens. Separat analys av βIII-tubulin fluorescens kanal möjliggör neurite utväxt segmentering (mitten panelen: cell organ som anges i blått (primär nervceller) eller gul (PC12), neurites i grönt (primär nervceller) eller ljusblå (PC12)). Analys av GFAP kanalen tillåter astrocyternas segmentering (Bottenplatta: kärnor som beskrivs i blått, cytoplasma i grönt). GFAP segmentering för den primära råttan hippocampus neuron / astrocyternas co-kulturen visar förmågan att skilja mellan kärnor / cell organ som är GFAP (+) (gröna konturer) och de som är GFAP (-) (röd), vilket möjliggör separata celler för nervceller och astrocyter i en blandad kultur inställning. 
Figur 2. Dos respons av primär råtta hippocampus neuron / astrocyternas co-kulturer till toxiska påfrestningar.
Primär råtta hippocampus astrocyter (P6) var pläterade på 96-brunnar i tillväxt media och odlade i 6 dagar. Primär råtta hippocampus neuroner (direkt från tina) då var seedade på toppen av pre-pläterade astrocyter och odlade i tillväxt media för 11 dagar. Cellerna behandlades med spädningar av akrylamid eller väteperoxid (max koncentrationer = 100 mm och 10 mm, respektive) för de senaste 24 timmarna av kultur. Cell hantering, fixering och immunfärgning utfördes enligt HCS222 analys protokoll. Celler var avbildade på GE i Cell Analyzer 1000 (3,3) på 20X (10 fält / brunn) och analyseras (kärnkraft / cytoplasmiska / neurite segmentering) med GE i Cell Analyzer 1000 Workstation (3,4) Neurite utväxt och Multi Target algoritmer analys. Data som presenteras är medelvärden ± SEM, n = 3. Flera parametrar (neurite utväxt, GFAP intensitet, astrocyternas området och neuronala eller astrocytic räknas cell) undersöktes för dosberoende trender.
Discussion
Hittills har in vitro-experiment för att studera bedömning neurotoxicitet risker med blandade kulturer av nervceller och astrocyter varit begränsad. Det är väl accepterat att gliaceller är integrerad i att tillhandahålla rumsliga och metabola stöd till nervceller, och spela en avgörande roll för modulerande flera neuronala funktioner, inklusive neuronala migration, differentiering och synaptisk aktivitet. Gliaceller astrocyter utsöndrar också cytokiner och andra lösliga faktorer som kan både inducera oönskade reaktioner i omgivande neuronal vävnad, samt främja neuronala tolerans för många gifter. Demonstration djupet av neuronala-gliaceller interaktioner, i samarbete kultur studier har astrocyter visat sig skydda nervceller mot toxiciteten av oxidativ stress, medan nedskrivningar av astrocytic funktioner, såsom underhåll av antioxidant försvar och cellulär energi nivåer, har visat sig kritiskt påverka neuronala överlevnad. Nyligen genomförda studier har antytt att användning av astrocyter i en in vitro neurotoxicitet test-systemet kan vara mer relevant för människors centrala nervsystemet struktur och funktion än neuronala celler ensam. Trots den ökande medvetenheten om den fysiologiska betydelsen av neuronala-astrocytic interaktioner har det varit tidigare svårt att utföra kvantitativa analyser av dessa interaktioner i intakta celler. Tillkomsten av Höga Content Screening möjliggör utvecklingen av nya kraftfulla analysmetoder för att lösa detta.
I denna studie har vi visat att kvantitativa analyser av flera neuronala och astrocytic fenotyper inom samma analys har gjorts möjligt genom HCA. I första hand nervceller har vi utfört kvantitativa mätningar av neurotoxicitet markörer som neuronala nummer, neurite räkna och neurite längd. I astrocyter, är reaktivt gliosis en känd biomarkör för neurotoxicitet, som kännetecknas av förändringar i GFAP uttryck, astrocyternas nummer och astrocyternas morfologi. Vi har visat att var och en av dessa effektmått lätt kan bedömas via HCA. Dessa studier stödjer uppfattningen att HCA av neural-specifika biomarkörer skulle kunna användas som en del av ett batteri av in vitro-tester för att snabbt skärm stort antal kemikalier för neurotoxiska slutpunkter.
Millipore är HCS222 Hög Content Analysis kit för samarbetet kultur av nervceller och astrocyter består av hög kvalitet upptäckt reagens och protokoll för samtidig profilering βIII-tubulin och gliaceller fibrillära sura protein (GFAP) i en mängd olika cellulära modeller av neurotoxicitet. Den högt validerade reagenser som medföljer denna sats tillåter användaren att standardisera analyser, minimera test-to-assay variation, och att reproducerbart generera bilder med en hög signal-bakgrund-förhållande.
Disclosures
Författarna är alla anställda av Millipore Corporation.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till Matthew Hsu, Jehangir Mistry och Michele Hatler för support under utvecklingen av dessa projekt och protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| H–chst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
|
| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 μL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 μL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
|
| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 μL of 250 μM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
|
| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
|
| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | |||
| HCS imaging/analysis system |
References
- Radio, N. M., Mundy, W. R. Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth. Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).
- Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening. Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).
- Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis. J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).
- Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells. Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).
- Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening. Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).
- Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).
- Prockop, L. D. The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology. J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).
- Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture. Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).
- Holden, L. J., Coleman, M. D. Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide. Toxicology. 241, 75-83 (2007).
- Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures. Brain Res. 1129, 43-52 (2007).
- Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).
- Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway. J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).
- O'Callaghan, J. P., Sriram, K. Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity. Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).
- Mead, C., Pentreath, V. W. Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity? Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).
- Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. Neurotoxicology In Vitro. , Taylor and Francis. London. 269-283 (1999).
- Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias. Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).
- Weible, M. W., Chan-Ling, T. Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes. Glia. 55, 1156-1168 (2007).
- Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro. Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).
- Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).
- Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines. Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).
