Summary
Cet article décrit un nouveau protocole et de réactif mis conçu pour la mesure sensibles des effets neurotoxiques de composés et de traitements sur les co-cultures de neurones et les astrocytes en utilisant l'analyse à haute teneur. Les résultats démontrent que l'analyse de contenu de haute technologie représente un roman passionnant pour l'évaluation de la neurotoxicité.
Abstract
Analyse à haute teneur (HCA) des dosages de combiner des cellules et des réactifs de détection par imagerie automatisée et de puissants algorithmes d'analyse d'image, permettant la mesure de plusieurs phénotypes cellulaires au sein d'un seul test. Dans cette étude, nous avons utilisé HCA pour développer un nouveau test de neurotoxicité. Neurotoxicité évaluation représente une partie importante de l'évaluation d'innocuité des médicaments, ainsi que l'accent étant importante des efforts de protection de l'environnement. Par ailleurs, la neurotoxicité est aussi un bien acceptée
Protocol
Préparation des cellules:
- Avant de semer la cellule pour le dosage, la culture des neurones / astrocytes dans les milieux de croissance jusqu'en ~ confluentes à 70-80% (sauf si la cellule de semis directement à partir de dégel ou d'isolement).
- Détachez les cellules de flacons de culture / plaques par la méthode appropriée pour le type de cellule d'intérêt. Si nécessaire, des puits d'essai manteau de la plaque avec les protéines de la matrice poly-D-lysine ou extracellulaire pour améliorer l'adhérence cellulaire. Co-cultures astrocytes et les neurones de l'peuvent être ensemencées simultanément ou successivement. Pour ensemencements séquentielle, le placage des astrocytes abord comme un «basale» couche est recommandée, suivie par l'ensemencement et la différenciation neuronale, si nécessaire. Ajuster la densité des cellules en fonction de type cellulaire, le temps de la culture subséquente, les paramètres d'intérêt, etc Selon l'âge de la culture, source de cellules et de la densité de semis, les cultures primaires peuvent varier considérablement en raison de la prolifération, l'expression de la GFAP ou neurites - il est important de caractériser et d'optimiser votre système de pile à fournir la meilleure pertinence biologique pour votre modèle expérimental, ainsi que pour fournir de l'imagerie efficace, la segmentation et l'analyse en utilisant HCS (voir Figure 1). Après l'ajout de cellules à l'assiette (les cellules peuvent être ensemencées dans 90 uL des médias, afin de faciliter le traitement de toxine telle que décrite à l'étape 3 ci-dessous), permettent la plaque de s'asseoir sur une surface plane à la température ambiante pendant 15-30 min, permettant la distribution, même cellule. Après cette période, les cellules incuber dans un milieu de croissance (37 ° C / 5% CO 2) pendant au moins 24 heures, puis passer à une différenciation des conditions de culture (par exemple, peu de sérum / NGF cellules PC12), le cas échéant. Poursuivre la culture jusqu'au niveau souhaité cellules atteignent la confluence ou de la différenciation, l'évolution des médias, à intervalles appropriés pour le type de cellule.
- Traitements par les cellules (composés de contrôle, composés d'essai, etc) peuvent être introduites à tout moment pendant cette période de culture, comme il convient pour le temps-durée du traitement de l'intérêt. L'acrylamide, le peroxyde d'hydrogène et le K-252a sont fournis sous forme de composés de contrôle neurotoxiques. Réactifs suffisants soient dégagés pour reproduire en 12 points des courbes dose-réponse (y compris un dH 2 O ou le DMSO-contrôle mis dans la dose-réponse) pour tous les cinq plaques de 96 puits. Les composés sont fournis à une concentration 250X (pour le K-252a, en supposant un traitement maximal de 1 uM) ou 10X (pour l'acrylamide et le peroxyde d'hydrogène, en supposant que les traitements maximum de 100 mM et 10 mM, respectivement). Le traitement recommandé consiste à préparer un demi-log (1: √ 10) de dilution en série du composé dans le DMSO 250X, suivi par dilution en tampon de dilution composé 10X (10X composés de contrôle originaires de dH 2 O peut être dilués en série directement dans stériles dH 2 O Tampon de dilution ou composé). 10 uL de chaque traitement peut alors être ajouté à la 90 uL de milieu de culture déjà présente dans chaque puits, pour une concentration finale 1X (0,4% de DMSO ou 10% dH 2 O). Exemple de données est prévue pour 24 ou 96 heures de traitement composé à 37 ° C avant la fixation.
Fixation des cellules et coloration par immunofluorescence:
Remarque: le temps de coloration est ~ 2,5 heures après la fixation. Ne laissez pas les puits de sécher entre les étapes de coloration. L'aspiration et la dispensation des réactifs doit être effectuée à faible débit pour réduire toute perte cellulaire due au cisaillement de fluides. Tous les recommandés »par puits« volumes se référer à un seul puits d'une microplaque de 96 puits. Tous les recommandés »par plaque de 96 puits" volumes comprennent l'excès de 25% pour la perte de volume de liquide de traitement. Toutes les étapes de coloration sont réalisées à température ambiante (RT). Tous les tampons et les solutions d'anticorps sont stables pendant au moins 24 heures à TA.
- À la fin de la période de culture, préchauffer solution de fixation HCS (2X) à température ambiante (RT) ou 37 º C si désiré (12 plaques mL/96-well). Dans une hotte, ajouter 100 ul / puits directement aux milieux de culture et de permettre de fixer pendant 30 min à température ambiante. Retirer fixateur / toxines contenant des médias et les éliminer dans le respect de la réglementation pour les déchets dangereux (voir fiche). Si procéder immédiatement à la coloration, rincer chaque puits deux fois avec 200 pi de tampon d'immunofluorescence HCS. Alternativement, si les plaques doivent être colorées à un moment plus tard, rincer deux fois avec 200 pi de tampon de lavage, puis laissez second rinçage de volume dans les puits et les plaques magasin hermétiquement fermés à 4 º C jusqu'à coloration.
- Si les échantillons fixés ont été stockés à 4 º C avant la coloration, rincer deux fois avec 200 pi de tampon d'immunofluorescence HCS avant de procéder à protocole de coloration.
- Préparer la solution de travail de lapin anti-tubuline βIII / Souris Anticorps anti-GFAP HCS primaire (6 plaques mL/96-well) comme suit: Ajouter 60 uL de chaque anticorps primaires décongelés à 5,88 ml de tampon d'immunofluorescence HCS. Mélangez bien. Retirer précédente tampon d'immunofluorescence rincer. Ajouter 50 ul de solution d'anticorps primaire dans chaque puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Éliminer l'anticorps primairesolution. Rincer trois fois avec 200 pi de tampon d'immunofluorescence HCS.
- Préparer la solution de travail de HCS Anticorps secondaire / Hoechst nucléaire HCS Stain (6 plaques mL/96-well) comme suit: Ajouter 30 uL de chaque anticorps décongelés secondaire et 30 uL d'décongelés nucléaire Hoechst Stain HCS à 5,91 ml de tampon d'immunofluorescence HCS. Mélangez bien, la protection de solution à partir de la lumière. Retirer précédente HCS immunofluorescence Tampon rincer. Ajouter 50 uL de HCS Anticorps secondaire / Hoechst HCS solution de colorant nucléaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante, protégé de la lumière.
- Retirer HCS secondaire Antibody / Hoechst HCS solution de colorant nucléaire. Rincer deux fois avec 200 pi de tampon d'immunofluorescence HCS.
- Retirer précédente HCS immunofluorescence Tampon rincer. Rincer deux fois avec 200 uL de tampon de lavage HCS, laissant second rinçage de volume dans les puits.
- Plaque de plaque d'étanchéité et de l'image immédiatement, ou conserver à 4 º C protégé de la lumière jusqu'au moment de l'imagerie.
Acquisition et analyse des images:
- Imagerie et l'analyse des plaques colorées peuvent être effectués sur une variété de plates-formes HCS disponibles, y compris l'EN analyseur de cellules (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Scientific) ou Opera (Perkin Elmer). Certaines lignes directrices pour l'imagerie et l'analyse sont présentés au tableau 1:
| HCS222 Directives Image Acquisition | |||
| Réactif de détection | Objectif Objectif | Gamme filtre d'excitation [pic / bande passante (nm)] | Filtre d'émission Range [pic / bande passante (nm)] |
| Hoechst HCS colorant nucléaire | 20X | 360/40 | 460/40 (535/50 ou, si nécessaire) |
| HCS anticorps secondaire, FITC-Donkey IgG anti-lapin | 20X | 480/40 | 535/50 |
| HCS anticorps secondaire, Cy3-Donkey IgG anti-souris | 20X | 535/50 | 600/50 |
HCS222 directives d'analyse d'images | |||
| Paramètre de maille | Détection | Segmentation / Mesure | Justification |
| Nombre de cellules, caractéristiques nucléaires | Hoechst HCS colorant nucléaire | La région nucléaire (460 nm canal d'émission). Compter le nombre de noyaux. Le contenu en ADN (intensité nucléaire) ou d'analyses domaine nucléaire sont également possibles. | Utilisez le numéro de cellulaire, caractéristiques nucléaires afin de déterminer la perte de cellules, les phénotypes de toxicité, etc Pouvez «filtre» des noyaux à ceux associés à βIII-tubuline ou expression GFAP pour obtenir séparée numération des cellules neuronales et astrocytaires / caractérisations (fortement recommandé). |
| βIII-tubuline expression, la croissance des neurites | HCS anticorps secondaire, conjuguée au FITC | Région cytoplasmique (535 nm d'émission de canal). Signaux FITC peuvent être utilisés pour distinguer les corps cellulaires neuronaux de neurites (par exemple, via minimum / moyenne des zones du corps cellulaire, les longueurs des neurites minimum / maximum et largeurs). Déterminer les paramètres comme la longueur des neurites total, compte neurites / cellulaire, etc | Mesures excroissance des neurites peut être modulée lors de la différenciation neuronale ou à la suite d'une blessure chimique, états de maladie, etc Pouvez «filtrer» les corps cellulaires pour ceux associés à βIII-tubuline l'expression pour obtenir la caractérisation distincts neuronale (fortement recommandé). |
| Expression GFAP, Zone astrocytes | HCS anticorps secondaire, Cy3-conjugués | Région cytoplasmique (600 nm canal d'émission). Signal en Cy3 peut être utilisé pour définir la segmentation astrocytaire cytoplasmique. Déterminer les paramètres tels que l'intensité moyenne du signal cytoplasmique, la zone de cellules, etc | L'expression la GFAP et de la zone de cellules astrocytaires peuvent être modulés au cours du développement des astrocytes ou en raison d'une blessure chimique, états de maladie, etc Pouvez «filtrer» les corps cellulaires pour ceux associés à une expression GFAP pour obtenir la caractérisation distincts astrocytaires (fortement recommandé). |
. Tableau 1 Image Directives acquisition et d'analyse - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (co-culture) Assay
Les résultats représentatifs:
Figure 1. βIII-tubuline et de la GFAP immunofluorescence des cultures mixtes de cellules neurales chez le rat.
Co-cultures d'astrocytes primaires de rat hippocampe soit avec les neurones primaires de rat hippocampe de rat ou cellules PC12 ont été générés par les astrocytes plaquage pendant plusieurs jours dans la culture, suivie par l'ensemencement des neurones. Neurones primaires ont été cultivées pendant 11 autres jours, tandis que PC12 ont été cultivées pendant 2 jours dans des conditions de différenciation (faible taux sérique / NGF). La manipulation des cellules, la fixation et immunomarquage ont été effectués selon les protocoles HCS222 dosage. Les cellules ont été imagées sur les GE en cellule d'analyse 1000 (3.3) à 20X (neurones primaires) ou 10X grossissement de l'objectif (PC12) et analysées à l'aide de la GE en cellule d'analyse 1000 Workstation (3,4) neurites et Multi algorithmes d'analyse de la cible panneau supérieur.: Les images fusionnées de Hoechst HCS Stain nucléaire (bleu), βIII-tubuline (vert) et GFAP (en rouge) par fluorescence. Une analyse distincte du canal de fluorescence βIII-tubuline permet une segmentation neurites (panneau du milieu: les corps cellulaires en bleu (les neurones primaires) ou jaune (PC12), neurites en vert (neurones primaires) ou bleu clair (PC12)). Analyse de la chaîne GFAP permet une segmentation des astrocytes (panneau du bas: noyaux en bleu, le cytoplasme en vert). La segmentation de la GFAP primaires d'hippocampe de rat neurone / astrocytes de co-culture démontre la capacité de distinguer entre les noyaux / cellules des organismes qui sont GFAP (+) (vert contours) et ceux qui sont GFAP (-) (rouge), permettant à nombre de cellules séparées pour neurones et les astrocytes dans un paramètre de culture mixte. 
Figure 2. Réponses à la dose de rat primaires hippocampiques neurone / co-cultures astrocytes aux stress toxiques.
Astrocytes primaires de rat hippocampique (P6) ont été déposées sur les plaques 96 puits dans les milieux de croissance et cultivées pendant 6 jours. Neurones hippocampiques primaires de rat (direct de dégel) ont ensuite été ensemencées sur le dessus de la pré-plaqués astrocytes et cultivées dans un milieu de croissance pendant 11 jours. Les cellules ont été traitées avec des dilutions successives de peroxyde d'hydrogène ou de l'acrylamide (max. concentrations = 100mm et 10mm, respectivement) pour les 24 dernières heures de culture. La manipulation des cellules, la fixation et immunomarquage ont été effectués selon les protocoles HCS222 dosage. Les cellules ont été imagées sur les GE en cellule d'analyse 1000 (3.3) à 20X (10 champs / puits) et analysés (nucléaire / cytoplasmique / neurites segmentation) en utilisant les GE en cellule d'analyse 1000 Workstation (3,4) neurites et Multi algorithmes d'analyse cible. Les données présentées sont des moyennes ± SEM, n = 3. Plusieurs paramètres (neurites, l'intensité GFAP, la zone des astrocytes et des numérations cellulaires neuronales ou astrocytaires) ont été étudiés pour dose-dépendante des tendances.
Discussion
À ce jour, dans des expériences in vitro destiné à étudier l'évaluation du risque de neurotoxicité utilisant des cultures mixtes de neurones et les astrocytes ont été limitées. Il est bien admis que les cellules gliales sont partie intégrante de fournir un soutien spatiale et métabolique pour les neurones, et jouent un rôle essentiel dans la modulation de plusieurs fonctions neuronales, y compris la migration neuronale, la différenciation et l'activité synaptique. Astrocytes gliales libèrent également des cytokines et d'autres facteurs solubles qui sont capables de tant de tolérance induisant des réactions indésirables dans les tissus environnants neuronale, ainsi que la promotion neuronale de nombreuses toxines. Démontrer la profondeur de neurones-glie interactions, en co-culture des études, les astrocytes ont été montré à protéger les neurones contre la toxicité du stress oxydatif, alors que le déficit des fonctions astrocytaires, comme l'entretien des défenses antioxydantes et les niveaux d'énergie cellulaire, a été démontré que influence déterminante sur la survie neuronale. Des études récentes ont suggéré que l'utilisation des astrocytes dans une neurotoxicité in vitro dans des systèmes de test peut s'avérer plus pertinentes pour la structure humaine du système nerveux central et la fonction que les cellules neuronales seul. Malgré la sensibilisation croissante de l'importance physiologique de neurones-astrocytes interactions, il a déjà été difficile d'effectuer des analyses quantitatives de ces interactions dans des cellules intactes. L'avènement du dépistage du contenu haute permet le développement de puissants nouveaux tests pour y remédier.
Dans cette étude, nous avons démontré que des analyses quantitatives de multiples phénotypes neuronaux et astrocytaire dans un dosage unique est rendue possible par la CHA. Dans les neurones primaires, nous avons effectué des mesures quantitatives des marqueurs de neurotoxicité tels que le nombre de neurones, comptent neurites et la longueur des neurites. Dans les astrocytes, gliose réactive est un biomarqueur de neurotoxicité connue, caractérisée par des altérations de l'expression GFAP, le nombre et la morphologie des astrocytes astrocytes. Nous avons démontré que chacun de ces paramètres peut être facilement évaluée par HCA. Ces études soutiennent l'idée que le HCA des neurones spécifiques biomarqueurs pourraient être utilisés comme partie d'une batterie de tests in vitro pour cribler rapidement un grand nombre de produits chimiques pour les terminaux neurotoxiques.
Millipore HCS222 kit Haute analyse du contenu pour la co-culture de neurones et les astrocytes est composée de réactifs de détection de haute qualité et des protocoles pour simultanément profilage βIII-tubuline et de protéines fibrillaire gliale acide (GFAP) dans une grande variété de modèles cellulaires de neurotoxicité. Les réactifs hautement validés fourni avec ce kit permettent à l'utilisateur de standardiser des tests, de minimiser test-à-test variabilité, et de façon reproductible générer des images avec un rapport signal sur bruit.
Disclosures
Les auteurs sont tous des salariés de Millipore Corporation.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matthieu Hsu, Jehangir Mistry et Michele Hatler de soutien lors du développement de ces projets et protocoles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| H–chst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
|
| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 μL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 μL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
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| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 μL of 250 μM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
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| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
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| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | |||
| HCS imaging/analysis system |
References
- Radio, N. M., Mundy, W. R. Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth. Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).
- Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening. Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).
- Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis. J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).
- Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells. Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).
- Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening. Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).
- Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).
- Prockop, L. D. The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology. J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).
- Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture. Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).
- Holden, L. J., Coleman, M. D. Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide. Toxicology. 241, 75-83 (2007).
- Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures. Brain Res. 1129, 43-52 (2007).
- Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).
- Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway. J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).
- O'Callaghan, J. P., Sriram, K. Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity. Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).
- Mead, C., Pentreath, V. W. Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity? Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).
- Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. Neurotoxicology In Vitro. , Taylor and Francis. London. 269-283 (1999).
- Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias. Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).
- Weible, M. W., Chan-Ling, T. Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes. Glia. 55, 1156-1168 (2007).
- Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro. Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).
- Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).
- Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines. Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).
