Summary
この記事では、新規プロトコルと試薬の高いコンテンツの分析を用いてニューロンとアストロサイトの共培養での化合物および治療の神経毒性効果の感度測定のために設計されたセットを説明します。結果は、高含有量の分析は、神経毒性評価のためのエキサイティングな新技術を表すことを示している。
Abstract
ハイコンテント分析（HCA）のアッセイは、単一のアッセイ内の複数の細胞の表現型の測定を可能にする、自動化されたイメージングと強力な画像解析アルゴリズムを持つ細胞と検出試薬を組み合わせる。本研究では、我々は神経毒性のための新しいアッセイを開発するためにHCAを利用。神経毒性評価は、重要な薬剤の安全性評価の一部だけでなく、環境保全活動の重要な焦点であることを表します。さらに、神経毒性にも広く受け入れられています
Protocol
細胞の準備：
- 増殖培地のアッセイは、培養ニューロン/アストロサイトのための細胞播種の前になるまで〜70-80％のコンフルエント（細胞が融解または分離から直接シードでない限り）。
- 目的の細胞の種類に適したメソッドを介して培養フラスコ/プレートから細胞を剥離する。必要に応じて、ポリ- D -リジン又は細胞外マトリックス蛋白質とコートのアッセイプレートのウェルに細胞接着を強化する。アストロサイトとニューロンの共培養は、同時または逐次にシードされる可能性があります。シーケンシャルseedingsの場合は、"基底"レイヤーとして最初のアストロサイトのメッキは、必要に応じて神経細胞のプレーティングと分化が続く、推奨されます。文化の時代、セルのソースおよび播種密度に応じて他のセルのタイプ、その後の培養時間、目的のパラメータ、に応じて細胞密度を調整し、初代培養は、増殖の速度、GFAPの発現や神経突起の伸長に大きく異なる場合があります - それは重要です特徴づけ、最適化して細胞のシステムをほとんどの生物学あなたの実験モデルの妥当性だけでなく、HCSを使用して効果的な画像処理、セグメンテーションと分析を提供するを提供する（図1参照）。プレート（細胞は以下のステップ3で説明したように毒素の治療を容易にするために、90μLメディアでシードされる可能性があります）にセルを追加した後、プレートをさらにcell配布を可能にする、15〜30分間室温温度でレベルの表面に座ってできます。増殖培地で、培養するには（37℃/ 5％CO 2）、分化の培養条件（例えば、PC12細胞の低血清/ NGF）に切り替えてから、少なくとも24時間はこの期間、必要に応じて、次の。細胞は細胞のタイプに適切な間隔でメディアを変更して、合流または分化の目的のレベルに達するまで培養を継続。
- 細胞治療は、（制御化合物、試験化合物、等）興味の治療の時間経過に応じて、この培養期間中の任意の時点で導入することができる。アクリルアミド、過酸化水素とK - 252Aは、神経毒性の制御化合物として提供されています。十分な試薬は、5つすべてを96ウェルプレート用の重複した12ポイントの用量反応曲線（用量反応内の一つのdH 2 OまたはDMSO -コントロールのセットを含む）のために用意されています。化合物は、250倍濃度（K - 252A用、1μMの最大の治療を想定）や10X（アクリルアミドおよび過酸化水素のため、それぞれ100 mMおよび10 mMの、最大の治療を想定）で提供されています。推奨される治療の準備には、ハーフログが含まれます：の化合物希釈緩衝液で希釈し、次いで（1√10）DMSO中の250X化合物の希釈系列を、10X（のdH 2 Oに起因10X制御化合物は、連続的滅菌のdH 2 Oで直接希釈してもよいまたは化合物の希釈バッファー）。各治療の10μLを、最終的な1X濃度（0.4％DMSOまたは10％のdH 2 O）のために、各ウェル内にすでに存在する培養培地90μLを加えてもよい。サンプルデータは、° C固定前に37℃で化合物の治療の24または96時間のために提供されています。
細胞の固定と免疫蛍光染色：
注：染色時間は約2.5時間後に固定です。井戸は、染色のステップ間を乾燥させないようにしてください。試薬の吸引と摂理は、流体の剪断に起因する任意のセルの損失を減少させるために低流量で実施されるべきである。すべての"ウェルあたりの推奨量は96ウェルマイクロプレートの1ウェルを参照してください。推奨されるすべての"当たり96 ウェルプレート"のボリュームは、液体の取扱量の損失の25％の超過などがあります。すべての染色ステップは室温（RT）で実行されます。すべてのバッファと抗体溶液を室温で少なくとも24時間安定です。
- 培養期間の終了時に、室温（RT）または37℃に予熱するHCSの固定液（2X）（12 mL/96-wellプレート）必要に応じて。化学煙フードでは、直接培地に100μl/ウェルを追加し、室温で30分間固定することができます。 （MSDSを参照）固定/毒素含有培地を取り除き、有害廃棄物規制に準拠して処分する。染色にすぐに進む場合、HCS免疫緩衝液200μlで二回の各ウェルを洗う。また、プレートはあとで染色される場合は、洗浄緩衝液200μlで二回リンス、2番目のしっかりと染色されるまで4℃で密封井戸や店舗のプレートでボリュームをすすぎ残す。
- 固定試料は染色する前に、4℃で保存されている場合は、染色プロトコールに進む前に200μLHCS免疫緩衝液で2回すすいでください。
- 次のように、ウサギ抗βIIIチューブリン/マウス抗GFAP HCS一次抗体（6 mL/96-wellプレート）のワーキング溶液を調製します：HCS免疫バッファの5.88 mLにそれぞれ解凍した一次抗体60μLを追加する。よく混ぜる。以前の免疫蛍光バッファリンス取り外します。各ウェルに一次抗体溶液50μLを追加し、室温で1時間インキュベートします。
- 一次抗体を除去ソリューション。 200μLHCS免疫の緩衝液で3回リンス。
- 次のようHCS二次抗体/ヘキストHCS核染色（6 mL/96-wellプレート）のワーキング溶液を調製します：それぞれの融解二次抗体30μLと融解ヘキストHCS核の30μLHCS免疫バッファの5.91 mLにステインを追加する。光からソリューションを保護する、よく混ぜる。すすぎ前のHCS免疫バッファを削除します。 HCS二次抗体/ヘキストHCS核染色液の50μLを追加し、光から保護RT、で1時間インキュベートする。
- HCS二次抗体/ヘキストHCS核染色溶液を除去。 200μLHCS免疫緩衝液で2回リンスします。
- すすぎ前のHCS免疫バッファを削除します。井戸第二リンスボリュームを残し、HCSの洗浄バッファーを200μLで二回リンスします。
- 4℃ですぐにシールプレートおよび画像、またはストアのプレートは、イメージングのための準備が整うまで、光から保護。
画像の収集と解析：
- ステンドグラスプレートのイメージングと解析は、Cell AnalyzerのIN（GEヘルスケア）、ArrayScan（ThermoFisherサイエンティフィック）やオペラ（パーキンエルマー社）を含む、利用可能なHCSプラットフォーム、様々な時に実行されることがあります。イメージングと解析のためのいくつかのガイドラインを表1に提供されています。
| HCS222画像集録ガイドライン | |||
| 検出試薬 | 対物レンズ | 励起フィルタ範囲[ピーク/帯域幅（nm）の] | エミッションフィルターレンジ[ピーク/帯域幅（nm）の] |
| ヘキストHCS核は染色 | 20X | 40分の360 | 40分の460（または必要に応じて50分の535） |
| HCS二次抗体、FITC -ロバ抗ウサギIgG | 20X | 40分の480 | 50分の535 |
| HCS二次抗体、Cy3でロバ抗マウスIgG | 20X | 50分の535 | 50分の600 |
HCS222画像解析のガイドライン | |||
| セルのパラメータ | 検出 | セグメンテーション/測定 | 論理的根拠 |
| 細胞数、核特性 | ヘキストHCS核は染色 | 核領域（460nmの発光チャネル）。核の数をカウントします。 DNAの含有量（核強度）や核領域の解析も可能です。 | セル損失、毒性の表現型、などが別々の神経細胞およびアストロサイトの細胞数/特性評価を得るためにβIII-チューブリンまたはGFAPの発現に関連するものを"フィルタ"核缶（強く推奨）を決定する細胞数、核特性を使用してください。 |
| βIII-チューブリンの発現、神経突起伸長 | HCS二次抗体、FITC結合 | 細胞質領域（535 nmの発光チャネル）。 FITCのシグナルは、神経突起（ 例えば 、最小値/平均細胞体領域を介して、最大値/最小神経突起の長さと幅）から神経細胞体を区別するために使用されることがあります。このような全体の神経突起の長さは、神経突起カウント/セル、などなどのパラメータを決定する | 神経突起伸長の測定は、神経細胞分化の過程や化学傷害、疾患の状態、等の結果として変調された可能性があります異なる神経細胞の特性を（強く推奨）を取得するためにβIII-チューブリンの発現に関連するものを"フィルタ"細胞体できます。 |
| GFAPの発現、アストロサイトエリア | HCS二次抗体、Cy3結合 | 細胞質領域（600 nm発光のチャネル）。 Cy3シグナルがアストロサイトの細胞質セグメンテーションを定義するために使用されることがあります。このような平均的な細胞質シグナル強度、セル面積、などのパラメータを決定する | GFAPの発現と星状細胞の面積は、アストロサイトの開発中または化学的傷害、疾患の状態の結果として変調された可能性がある、などが明確な星状膠細胞の特性を（強く推奨）を取得するためにGFAP発現と関連するもののために細胞体を"フィルタリング"することができます。 |
表1画像取得と分析ガイドライン- HCS222βIII-Tubulin/GFAP（共培養）アッセイ
代表的な結果：
図1。 βIII-チューブリン及びGFAP immunofluore混合ラットの神経細胞培養のscence。
PC12細胞は神経細胞の播種に続いて、培養中の数日間前めっきのアストロサイトによって生成された初代ラット海馬神経細胞またはラットのいずれかと初代ラット海馬アストロサイトの共培養。 PC12sが分化条件（低血清/ NGF）の下にさらに2日間培養しながら一次ニューロンは、追加の11日間培養した。セル処理、固定および免疫染色HCS222アッセイのプロトコールに従って実施した。細胞は20倍（一次ニューロン）や10X（PC12）客観的な倍率でセルアナライザー1000（3.3）でGE上に結像し、セルアナライザー1000ワークステーション（3.4）神経細胞とマルチターゲット分析のアルゴリズムではGEを用いて分析したトップパネルが。：ヘキストHCSステイン核（青）、βIII-チューブリン（緑）およびGFAP（赤）蛍光の融合画像。別βIII-チューブリンの蛍光チャネルの解析神経突起伸長のセグメンテーションを可能にする（ 中央のパネル：青（一次ニューロンに記載されている細胞体）や黄色（PC12）、緑（一次ニューロンの神経突起）や水色（PC12））。 GFAPのチャネルの分析は、アストロサイトセグメンテーション（：青、緑の細胞質に記載されている核下のパネル ）が可能になります。に別々のセルのカウントを可能にする、（赤） - （）ラット初代海馬ニューロン/アストロサイトの共培養のためのGFAPのセグメンテーションは、GFAP（+）（緑アウトライン）とGFAPされるものである核/細胞体を区別する能力を示しています混合培養設定のニューロンとアストロサイト。 
図2。毒性ストレスに対するラット初代海馬ニューロン/アストロサイト共培養の用量が応答。
初代ラット海馬アストロサイトは、（P6）増殖培地で96ウェルプレートに播種し、6日間培養した。初代ラット海馬ニューロンを（解凍から直接）、事前メッキアストロサイトの上に播種し、11日間増殖培地で培養した。細胞は、培養の最後の24時間のアクリルアミドまたは過酸化水素（最大濃度= 100mMのと10mm、それぞれ）の連続希釈液で処理した。セル処理、固定および免疫染色HCS222アッセイのプロトコールに従って実施した。セルはセルアナライザー1000ワークステーション（3.4）神経細胞とマルチターゲット分析のアルゴリズムではGEを使用して（細胞質/核/神経突起セグメンテーション）20X（よく10フィールド/）でセルアナライザー1000（3.3）にGE上に結像し、分析した。提示されたデータは平均± SEM、n = 3のを。複数のパラメータを（神経突起伸長、GFAPの強度、アストロサイトの領域と神経やアストロサイトの細胞数）用量依存性の傾向を調べた。
Discussion
日付に、ニューロンおよびアストロサイトの混合培養を用いた神経毒性のリスク評価を研究するために設計されたin vitroの実験では限定されている。それは、グリア細胞が神経細胞に空間的および代謝のサポートを提供するのに不可欠であり、神経細胞遊走、分化、シナプス活動を含む変調いくつかの神経機能に重要な役割を果たすことはよく受け入れられている。グリアアストロサイトはまた、サイトカインと神経組織の周囲に有害反応を誘発するだけでなく、多くの毒素の神経細胞寛容を促進するの両方が可能である他の可溶性因子を放出する。神経 - グリア相互作用の深さを実証する、共培養の研究において、アストロサイトはそのような抗酸化防御と細胞のエネルギーレベルの維持など、アストロサイトの機能、、の減損がすることが示されているのに対し、酸化的ストレスの毒性に対して神経細胞を保護することが示されている批判的にニューロンの生存に影響を与える。最近の研究では、in vitroでの神経毒性試験システムでのアストロサイトの使用は、単独で神経細胞よりも人間の中枢神経系の構造と機能に、より関連性の高い証明するかもしれないことを示唆している。神経 - アストロサイト相互作用の生理的意義の意識の高まりにもかかわらず、それは以前に、インタクトな細胞で、これらの相互作用の定量的な分析を実行することは困難であった。ハイコンテントスクリーニングの出現は、この問題に対処する強力な新しいアッセイの開発が可能になります。
本研究では、我々は、単一のアッセイ内の複数のニューロンとアストロサイトの表現型の定量分析はHCAにより可能にされていることを明らかにした。一次ニューロンでは、ニューロン数、神経突起の数や神経突起の長さなどの神経毒性マーカーの定量的測定を実施している。アストロサイトでは、反応性神経膠症はGFAPの発現、アストロサイト数とアストロサイトの形態の変化によって特徴付けられる神経毒性の既知のバイオマーカー、です。我々は、これらのエンドポイントの各々が容易にHCAを経由して評価することができることを実証した。これらの研究は、神経特異的なバイオマーカーのHCAが急速に神経毒性のエンドポイント用化学薬品を大量にスクリーニングするin vitro試験での電池の一部として使用することができるという概念をサポートしています。
ニューロンとアストロサイトの共培養のためのミリポアのHCS222ハイコンテンツ分析キットは、高品質の検出試薬と同時に神経の細胞モデルの様々なβIII-チューブリンとグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）をプロファイリングするためのプロトコルで構成されています。このキットに付属して高度に検証された試薬は、ユーザーは、アッセイの標準化アッセイ間アッセイのばらつきを最小限に抑え、かつ再現性の高い信号対バックグラウンド比を持つ画像を生成することができます。
Disclosures
著者らは、ミリポア社の全従業員です。
Acknowledgments
著者は、博士に感謝します。これらのプロジェクトとプロトコルの開発中に支援のためのリックライアン、Umesh Patelさん、ジェフティル、マシュースー、JehangirミストリーとミケーレHatler。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| H–chst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
|
| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 μL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 μL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
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| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 μL of 250 μM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
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| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
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| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | |||
| HCS imaging/analysis system |
References
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