Summary
В этой статье описывается новый протокол и набор реагентов предназначен для чувствительной измерения нейротоксического действия соединений и процедур о сотрудничестве культур нейронов и астроцитов с использованием высоких контент-анализ. Результаты показывают, что высокие контент-анализ представляет захватывающий роман технологии для нейротоксичности оценки.
Protocol
Сотовые приготовления:
- До посева ячейки для анализа, культуру нейронов / астроциты в питательной среде до ~ 70-80% сливной (если ячейка посева непосредственно от оттепели или изоляции).
- Отсоедините клетки от культуры колбы / пластин через метод, соответствующий типу клеток, представляющих интерес. Если необходимо, пальто анализа пластины скважин с поли-D-лизина или внеклеточного матрикса белка для повышения адгезии клеток. Сотрудничество культур астроцитов и нейронов могут быть посеяны одновременно или последовательно. Для последовательного рассада, покрытие астроцитов сначала как "базальных" слой рекомендуется, а затем нейронов покрытия и дифференциации, если это необходимо. Отрегулируйте плотность клеток в зависимости типа клеток, последующее время культура, параметры проценты и т.д. В зависимости от культуры возрасте, источником клеток и плотности посева, первичных культур могут значительно различаться по скорости распространения, GFAP выражение или аксонов - это важно характеризуют и оптимизировать клеточной системы, чтобы обеспечить наиболее биологической значимости для вашей экспериментальной модели, а также для обеспечения эффективной обработки изображений, сегментации и анализа с использованием ЖКХ (см. Рисунок 1). После добавления клетки пластины (клетки могут быть посеяны в 90 мкл средства массовой информации, чтобы облегчить токсина лечение, как описано в шаге 3 ниже), позволяют пластины, чтобы сидеть на ровной поверхности при комнатной температуре в течение 15-30 мин, что позволяет даже распределения клеток. После этого периода инкубации клеток в питательной среде (37 ° C / 5% CO 2), по крайней мере 24 часов, затем переключиться в условиях дифференциации культуры (например, низкая сыворотки / NGF для PC12 клетки), в случае необходимости. Продолжить культуры до клетки достигают желаемого уровня слияния или дифференциации, изменение средств массовой информации с интервалом подходит для типа клеток.
- Сотовые лечения (контроль соединений, проверить соединения и т.д.) могут быть введены в любой момент в течение этого периода культивирования, в случае необходимости на время курса лечения, представляющих интерес. Акриламид, перекись водорода и К-252 поставляются как нейротоксическое соединений контроля. Достаточное реагенты при условии одинаковых 12-балльной дозовой кривые (в том числе один дН 2 O или ДМСО-контроля, установленным в зависимости реакции от дозы) для всех пяти 96-луночных планшетах. Соединений приведены на 250X концентрации (К-252, при условии максимального лечения 1 мкМ) или 10х (для акриламида и перекись водорода, принимая во внимание максимальную лечения 100 мм и 10 мм соответственно). Рекомендуемое лечение подготовка включает в себя половину журналов (1: √ 10) серийные разведения 250X соединения в ДМСО, с последующим разбавлением в соединения буфера разбавления до 10X (10X соединений контроль происходящие в дН 2 O может быть последовательно разбавлены непосредственно в стерильных дН 2 O Буфер соединения или разбавления). 10 мкл каждого лечения может быть добавлена в 90 мкл культуральной среды уже присутствуют в каждой лунке, для окончательного 1X концентрации (0,4% ДМСО или 10% дН 2 O). Пример данных осуществляется в течение 24 или 96 часов сложного лечения при 37 ° С до фиксации.
Фиксация клеток и иммунофлуоресцентного окрашивания:
Примечание: Окрашивание время составляет ~ 2,5 часа после фиксации. Не позволяйте лункам высыхать между окрашиванием шагов. Стремление и устроение реагентов следует проводить при низких скоростях потока уменьшить любую ячейку потери из-за сдвига жидкости. Все рекомендованные "на скважину" объемы относятся к одной скважины в 96-ю лунками. Все рекомендованные "в 96-луночного планшета" тома включают 25% избыточной для жидких потери объема обработки. Все окрашивания действия выполняются при комнатной температуре (RT). Все буферы и антител решения устойчивы, по крайней мере 24 часов при комнатной температуре.
- В конце периода культивирования, предварительно теплой ЖКХ Фиксация Решение (2X) до комнатной температуры (RT) или 37 º C при желании (12 mL/96-well пластины). В химический вытяжной шкаф, добавьте 100 мкл / лунку прямо на культуру средств массовой информации и позволяют фиксировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалить фиксатором / токсин средах и распоряжаться им в соответствии с нормативами для опасных отходов (см. MSDS). Если немедленно приступить к окрашиванию, промыть каждую лунку в два раза с 200 мкл буфера ЖКХ иммунофлуоресценции. Или же, если пластины следует окрашенных в более позднее время, промойте в два раза с 200 мкл промывочного буфера, а затем оставить второго полоскания объем в скважинах и хранить пластины плотно закрытыми при температуре 4 º C до окрашивания.
- Если основные образцы были хранить при температуре 4 º C до окрашивания, промыть в два раза с 200 мкл ЖКХ иммунофлуоресценции буфера прежде чем приступать к окрашиванию протокола.
- Подготовка рабочего раствора Кролик Anti-βIII тубулина / мыши Anti-GFAP ЖКХ первичных антител (6 mL/96-well пластины) следующим образом: Добавить 60 мкл каждого талой первичных антител до 5,88 мл буфера ЖКХ иммунофлуоресценции. Хорошо перемешайте. Удалите предыдущие иммунофлуоресценции буфера полоскания. Добавить 50 мкл первичных антител решение в каждую лунку и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Удалить первичный антителрешение. Промыть в три раза с 200 мкл буфера ЖКХ иммунофлуоресценции.
- Подготовка рабочего раствора ЖКХ вторичными антителами / Hoechst ЖКХ ядерной пятна (6 mL/96-well пластины) следующим образом: Добавить 30 мкл каждого талой вторичными антителами и 30 мкл талой Hoechst ЖКХ ядерной пятна до 5,91 мл буфера ЖКХ иммунофлуоресценции. Хорошо перемешайте, защищая решение от света месте. Удалите предыдущие ЖКХ иммунофлуоресценции буфера полоскания. Добавить 50 мкл ЖКХ вторичными антителами / Hoechst ЖКХ ядерной пятно раствором и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре, в защищенном от света.
- Удалить ЖКХ вторичными антителами / Hoechst ЖКХ ядерной пятно раствором. Промыть два раза с 200 мкл буфера ЖКХ иммунофлуоресценции.
- Удалите предыдущие ЖКХ иммунофлуоресценции буфера полоскания. Промыть два раза с 200 мкл буфера ЖКХ промыть, оставляя вторую промыть объем в скважинах.
- Пластины печать и изображения сразу или хранить пластины при температуре 4 ° С в защищенном от света до готовности для работы с изображениями.
Приобретение и анализа изображений:
- Работа с изображениями и анализ окрашенных пластин может осуществляться на различных доступных платформ ЖКХ, в том числе сотовый В Analyzer (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Научно) или Opera (Perkin Elmer). Некоторые руководящие принципы для создания образов и анализа приведены в Таблице 1:
| HCS222 Руководство Image Acquisition | |||
| Обнаружение реагент | Объектив | Возбуждение фильтра диапазона [пик / пропускной способности (нм)] | Эмиссия фильтра диапазона [пик / пропускной способности (нм)] |
| Hoechst ЖКХ ядерной пятно | 20X | 360/40 | 460/40 (или 535/50 при необходимости) |
| ЖКХ вторичными антителами, FITC-Donkey анти-IgG кролика | 20X | 480/40 | 535/50 |
| ЖКХ вторичными антителами, Cy-3-Donkey анти-IgG мыши | 20X | 535/50 | 600/50 |
HCS222 Руководство анализ изображений | |||
| Сотовые параметров | Обнаружение | Сегментация / Измерение | Обоснование |
| Сотовый номер, ядерные характеристики | Hoechst ЖКХ ядерной пятно | Ядерная область (460 нм излучения канала). Подсчитать количество ядер. Содержание ДНК (ядерной интенсивности) или ядерной анализы области также возможны. | Используйте номер ячейки, ядерные характеристики, чтобы определить потерю клеток, токсичности фенотипы и т.д. Может "фильтр" ядер для тех, кто связан с βIII-тубулина или GFAP выражение для получения отдельных нейронов и астроцитов клеток / характеристики (настоятельно рекомендуется). |
| βIII-тубулина слова, аксонов | ЖКХ вторичными антителами, FITC-сопряженных | Цитоплазматическая области (535 нм излучения канала). FITC сигнала может быть использован для отличать тела нейронов из невриты (например, через минимальное / среднее тело клетки областях, минимальная / максимальная длина аксонов и ширины). Определить такие параметры, как общая длина аксонов, нейритов отсчетов / клетка и т.д. | Измерения аксонов могут модулироваться при дифференциации нейронов, либо в результате химических травм, болезненных состояний и т.д. Может "фильтр" клеточных тел для тех, кто связан с βIII-тубулина выражение для получения различных характеристик нейронов (настоятельно рекомендуется). |
| GFAP слова, астроцитов Площадь | ЖКХ вторичными антителами, Cy-3-сопряженных | Цитоплазматическая области (600 нм излучения канала). Cy3 сигнала может быть использован для определения астроцитарных цитоплазматических сегментации. Определить такие параметры, как средняя цитоплазматических интенсивность сигнала, мобильный области и т.д. | GFAP выражения и астроцитов площадь ячейки может быть модулированных во астроцитов развития или в результате химической травмы, болезненных состояний и т.д. Может "фильтр" клеточных тел для тех, кто связан с GFAP выражение для получения различных астроцитарных характеристику (настоятельно рекомендуется). |
Таблица 1. Image Acquisition и анализа руководящих принципов - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Со-культуры) Пробирной
Представитель Результаты:
Рисунок 1. βIII-тубулина и GFAP immunofluorescence смешанных крысы нейронных клеточных культурах.
Сотрудничество культур первичных гиппокампа крысы астроциты либо с первичных нейронов гиппокампа крысы или крысы РС12 клетки были получены путем предварительного покрытия астроциты в течение нескольких дней в культуре, а затем нейронов посева. Первичная нейроны культивировали в течение еще 11 дней, а PC12s культивировали в течение дополнительных 2 дней при дифференциации условий (низкая сыворотки / NGF). Сотовые обработки, фиксации и иммунной были выполнены в соответствии с HCS222 протоколы анализа. Клетки были обследованы на GE В Сотовые Analyzer 1000 (3.3) на 20X (первичные нейроны) или 10X (РС12) цель увеличения и проанализированы с помощью GE В Сотовые Analyzer 1000 Workstation (3,4) нарост аксонов и мульти алгоритмы анализа целевой Верхняя панель.: Плавленый образы Hoechst ЖКХ ядерной пятна (синий), βIII-тубулина (зеленый) и GFAP (красный) флуоресценции. Отдельный анализ βIII-тубулина флуоресценции канал позволяет нейритов сегментации результат (в центре панели: клеточных тел, изложенные в синий (первичные нейроны) или желтого (РС12), невриты в зеленом (первичные нейроны) или голубой (РС12)). Анализ канала GFAP позволяет астроцитов сегментации (нижняя панель: ядра, изложенные в синий, цитоплазмы в зеленый цвет). GFAP сегментации для первичных нейронов гиппокампа крыс / астроцитов совместно культуры демонстрирует способность различать между ядрами / клеточных тел, которые GFAP (+) (зеленый очертания) и те, которые GFAP (-) (красный), что позволяет отдельным подсчитывает ячейки для нейроны и астроциты в смешанной настройка культуры. 
Рисунок 2. Доза ответы первичных нейронов гиппокампа крыс / астроцитов совместно культур токсичных напряжений.
Первичная гиппокампа крысы астроциты (P6) высевали на 96-луночных планшетах в питательной среде и культивировали в течение 6 дней. Первичная гиппокампа крыс нейроны (напрямую из оттепель), затем были посеяны на вершине предварительно покрытием астроциты и культивировали в питательной среде в течение 11 дней. Клетки обрабатывали серийных разведений акриламида или перекись водорода (макс. концентрация = 100 мм и 10 мм соответственно) за последние 24 часа культуры. Сотовые обработки, фиксации и иммунной были выполнены в соответствии с HCS222 протоколы анализа. Клетки были обследованы на GE В Сотовые Analyzer 1000 (3.3) на 20X (10 полей / лунку) и проанализированы (ядерное / цитоплазматических / нейритов сегментации) с помощью GE В Сотовые Analyzer 1000 Workstation (3,4) нарост аксонов и мульти алгоритмы анализа Target. Представленные данные среднее ± SEM, п = 3. Несколько параметров (аксонов, GFAP интенсивности, астроцитов и нейронов области или астроцитарных-клеток) были исследованы зависимости от дозы тенденций.
Discussion
На сегодняшний день в пробирке эксперименты по изучению нейротоксичности оценки риска использования смешанных культур нейронов и астроцитов были ограничены. Хорошо принято считать, что глиальные клетки являются неотъемлемой частью в обеспечении пространственной и метаболическую поддержку для нейронов, и играют важную роль в модуляции нескольких нейронов функций, включая миграцию нейронов, дифференциацию и синаптической активности. Глиальных астроцитов также выпустит цитокинов и других растворимых факторов, которые способны как вызывать неблагоприятные реакции в окружающих нейронов ткани, а также поощрение терпимости нейронов многих токсинов. Демонстрация глубины нейронов, глиальных взаимодействий, в со-культурологи, астроциты, как было показано защитить нейроны от токсичности окислительного стресса, в то время как нарушение астроцитарных функций, таких как поддержание антиоксидантной защиты и клеточном уровнях энергии, как было показано, критически влияния нейронов выживания. Недавние исследования показали, что использование в астроциты в пробирке нейротоксичности тест-система может оказаться более актуальны для организма человека центральную нервную структуру системы и функции нервных клеток, чем в одиночку. Несмотря на растущее понимание физиологического значения нейронов-астроцитарных взаимодействия, оно ранее было трудно выполнять количественный анализ этих взаимодействий в неповрежденных клетках. Появлением высокопроизводительного скрининга Содержимое позволяет разрабатывать новые мощные тесты, чтобы решить эту проблему.
В этом исследовании мы показали, что количественный анализ нескольких нейронов и астроцитов фенотипов в пределах одного анализа стало возможным благодаря HCA. В первичных нейронов мы выполнили количественные измерения нейротоксичности маркеров, таких как нейронные номер, нейритов считать и аксонов длины. В астроциты, реактивной глиоз известная биомаркера нейротоксичность, характеризуется изменениями в GFAP выражения, астроцитов количество и астроцитов морфологии. Мы показали, что каждая из этих конечных точек можно легко оценить с помощью HCA. Эти исследования подтверждают концепцию, что HCA нейронных конкретных биомаркеры могут быть использованы как часть батареи тестов в пробирке быстро экране большого числа химических веществ для нейротоксическое конечных точек.
HCS222 Millipore высокомощная комплект Анализ содержимого для совместного культуры нейронов и астроцитов состоит из высококачественного обнаружения реагентов и протоколов для одновременного профилирования βIII-тубулина и глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) в самых различных клеточных моделях нейротоксичность. Высоко подтвержденным реагентам, поставляемый с этим комплект позволяет пользователю стандартизировать анализы, свести к минимуму анализа до анализа изменчивости и воспроизводимо генерировать изображения с высоким отношением сигнала к фону.
Disclosures
Авторы всех сотрудников Millipore Corporation.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Рик Райан, Umesh Патель, Джефф До, Мэтью Хсу, Джехангир Мистри и Мишель Hatler за поддержку в процессе разработки этих проектов и протоколов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| H–chst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
|
| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 μL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 μL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
|
| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 μL of 250 μM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
|
| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
|
| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | |||
| HCS imaging/analysis system |
References
- Radio, N. M., Mundy, W. R. Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth. Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).
- Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening. Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).
- Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis. J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).
- Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells. Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).
- Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening. Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).
- Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).
- Prockop, L. D. The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology. J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).
- Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture. Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).
- Holden, L. J., Coleman, M. D. Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide. Toxicology. 241, 75-83 (2007).
- Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures. Brain Res. 1129, 43-52 (2007).
- Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).
- Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway. J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).
- O'Callaghan, J. P., Sriram, K. Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity. Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).
- Mead, C., Pentreath, V. W. Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity? Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).
- Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. Neurotoxicology In Vitro. , Taylor and Francis. London. 269-283 (1999).
- Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias. Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).
- Weible, M. W., Chan-Ling, T. Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes. Glia. 55, 1156-1168 (2007).
- Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro. Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).
- Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).
- Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines. Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).
