Summary
我们描述一个简单的协议，以确定大脑的蛋白质结合ATP门控P2X2受体的C末端全长。这种方法的延伸和系统应用到所有P2X受体预计将导致一个更好地了解P2X受体信号。
Abstract
配体门控离子通道1在中枢神经系统的突触联系的基础。在哺乳动物中，有三个家庭的配体门控通道：循环的半胱氨酸，谷氨酸门控和P2X受体通道 2 。在每一种情况下变送器具有约束力，导致毛孔开放，通过离子流及其电化学梯度。许多配体门控通道，也渗透到钙离子的3，4，有下游信号的角色（如基因调控），可能会超过通道的开放时间。因此，配体门控通道信号在广泛的时间尺度从几毫秒到数天不等。鉴于这些重要的角色，有必要了解如何配体门控离子通道本身是由蛋白质所规管，以及如何将这些蛋白质可能调整的信号。最近的研究表明许多，如果不是全部的渠道可能是部分蛋白信号复合物6。在这篇文章中，我们将解释如何识别的蛋白质结合P2X2受体胞浆域的C -末端的各个方面。
P2X受体是ATP门控的阳离子通道，由7个亚基（P2X1，P2X7）组成。 P2X受体广泛表达在大脑中，在那里他们介导兴奋性突触传递和神经递质的释放 7的突触前便利。 P2X受体在兴奋和非兴奋性细胞介导的神经信号，炎症和心血管功能 8的关键角色。 P2X2受体在神经系统的9的丰富，是本研究的重点。每个P2X亚基被认为是拥有两个膜跨越段（TM1和TM2）的，由胞外区 7和细胞内的N和C末端（图1A）7分开。 P2X亚基10（P2X1，P2X7）显示30-50％的序列同源性氨基酸水平的 11 。 P2X受体只包含三个亚基，这是最简单的离子型受体的化学计量。 P2X2 C -末端由120个氨基酸（图1b）组成，并含有几种蛋白质对接的共识网站，支持这一假设P2X2受体信号复合物的一部分。不过，虽然有几个功能已被归因于P2X2受体9 C -末端没有研究描述分子的合作伙伴，这种蛋白质通过细胞内C -末端全长夫妇。在此方法纸中，我们描述了蛋白质组学的方法来识别与P2X2受体的C -末端全长相互作用的蛋白质。
Protocol
实验步骤
实验步骤（图2）包括四个部分，下面是一个分步进行的方式描述。
第1部分：亚克隆和表达P2X2受体的C -末端。
我们已经表达P2X2受体在细菌的C -末端全长识别脑蛋白与之结合。
- C -末端（残基353-472）的P2X2受体（图1）经PCR扩增，克隆到PGEX 4NT1（GE生命科学）和测序验证。
- 重组质粒转化E.表达重组蛋白的大肠杆菌（BL21） 。
- 甘油包含P2X2 CT - GST重组质粒的细菌（大肠杆菌BL21）股票被刮掉，用无菌枪头，接种到5毫升卢里亚Bertani（LB）媒体与合适的选择标记“（50克/ mL氨苄青霉素）和在37C轨道摇床孵育过夜。
- 用适当的抗生素（50μg/ mL氨苄青霉素），分别接种到250毫升LB培养基过夜的文化37C在轨道摇床孵育2-3小时在250 RPM，直到在600 nm的光密度达到~~ 0.6-0.7。
- 文化是1毫米的IPTG诱导蛋白表达3小时，并进一步培养在37C。
- 当时的文化纺5000克4C（文化1毫升是保存的表达水平进行分析，并标示为“诱导”）为15分钟。弃上清液，沉淀重悬于20毫升生理盐水（STE）的Tris - EDTA缓冲液（10毫米的Tris - HCl，150 mM氯化钠，1 mM EDTA的pH值8.0）。
- 暂停15分钟在50毫升猎鹰管纺5000克。弃上清液和半干燥的颗粒被冻结在- 70C过夜。
- - 70C颗粒，悬浮在冰冷的裂解液（2％（W / V）sarkosyl 15毫克，溶菌酶，氯化钠150毫米，50毫米的Tris PH7.5，5毫米DTT和完整的蛋白酶抑制剂片）40毫升冰浴30分钟，和悬浮培养。在此孵化，3毫升谷胱甘肽琼脂糖4B珠20毫升磷酸缓冲液（PBS）和20毫升的T - PBS（0.1％（V / V）的PBS tritonX - 100），然后用PBS洗涤。珠子悬浮在1 mL PBS。
- 菌悬液冷冻在液氮中解冻3次，超声（1S开/关，冰3分钟30微米），并进一步培养30分钟，用4％（V / V）Triton X - 100，10 mM的硫酸镁4和2毫米ATP在冰上。
- 20000克，4C和沉淀15分钟，被丢弃（沉淀和SDS - PAGE保存到测试在细胞质和细胞膜蛋白质的量的1毫升上清样本）裂解液中剥离出来。上清孵育1小时（或过夜），在4C的珠子。
- 纺500克珠5分钟，弃上清液（样品保存的未绑定的分数）。珠洗的T - PBS五倍（涤洗控制保存）。
- 珠子，然后悬浮在PBS给予50％（W / V）浆，存放在冰箱，直到使用4C。估计蛋白浓度由Bradford法（每制造商的指示）。
第2部分：全脑裂解液的制备
P2X2受体是已知的要丰富大脑中的8的表达。在目前的分析，我们试图找出与P2X2受体从大鼠全脑细胞裂解液（图3）相互作用的蛋白质。
- 成年大鼠脑收获（处死动物，根据加州大学洛杉矶分校IAACUC批准的协议，并根据美国国立卫生研究院实验动物的照顾和使用指南），并立即冲洗冰冷的PBS（3X）。
- 裂解细胞（10毫升〜5倍的收获脑湿重）冰冷的裂解缓冲液含有150毫米的NaCl，50毫米的Tris - HCl，pH值7.4，10 mM的EDTA，EGTA 1毫米，1毫米的氟化钠，1毫米娜3 VO 4 PMSF，1毫米，5微克/毫升的亮肽素，1％（V / V）NP - 40，和一种蛋白酶抑制剂的鸡尾酒平板添加到收获的大脑。
- 脑组织均质玻璃Dounce匀浆冰，直到混合均匀的一致性。
- 在2000克5分钟取出完整的细胞，细胞裂解液中剥离出来。上清收集和纺60分钟再次删除完整的细胞器和膜聚集在29000克。
- 离心后的上清液转移到一个干净的管。全脑裂解液的蛋白浓度测定Bradford法（通常〜15毫克/毫升）。
- 裂解液分装和存储在- 70C。
第3部分：P2X2的C -尾部相关蛋白的分离
为了确定P2X2 CT - GST的具有约束力的合作伙伴，从整个大脑细胞裂解液，一拉下来检测，通过使用CT - GST固定在谷胱甘肽琼脂糖4B珠为诱饵。对于控制，消费税单独绑定珠使用。
- 脑裂解precleared在4C 1小时的消费税珠。颗粒被丢弃上清液用于进一步分析。
- 同等数量的商品及服务税和P2X2的CT - GST（10微克）绑定谷胱甘肽琼脂糖4个B珠孵育过夜，100克precleared可溶性蛋白大鼠全脑裂解液，裂解液4C的转动。
- 珠纺在1000克5分钟，弃上清液。
- 珠裂解液洗一次，并在修改Laemli缓冲液煮沸4％（W / V）SDS，10％（V / V）2 - 巯基乙醇，甘油2％（V / V），0.004％（W / V）溴酚蓝和0.125中号TrisCl pH值6.8] 5分钟。
- 对样品进行了5分钟和10％的SDS - PAGE（图4）分离的上清纺5000克。凝胶染色SYPRO Ruby的蛋白凝胶染色（按制造商的指示）和在紫外线照射下的可视化。 P2X2的CT相关蛋白进行了比较与回收为诱饵，利用GST空。 4个生物复制被执行（即4个大脑和4个独立的下拉）。
第4部分：蛋白质的鉴定。
凝胶电泳分离的蛋白质从凝胶上切下 ，注意通过质谱12鉴定：在整个过程中没有灰尘，以减少角质污染的关键。 实验者应戴上口罩，发网和手套，在任何时候都永远无法触摸凝胶地区利益，没有使用手套。
- P2X2下拉收回所有可见的蛋白质乐队用干净的刀片切和泡（图4）。 GST空相应的凝胶地区下拉巷也以同样的方式切除，而不带染色（GST空诱饵特定的频段也被切除，并确定）以下的水平，以确保蛋白质的存在染色的灵敏度是不容错过。
- 凝胶片孵育50毫米碳铵200μL50％（V / V）乙腈（ACN），在室温下15分钟振荡管。重复此清洗步骤。
- 凝胶片加入200μL乙腈（凝胶块收缩，成为不透明的颜色）脱水。
- 乙腈被删除，干凝胶块〜10分钟speedvac。
- 30μL新鲜配制的10 mM的DTT/10 mM的三（2 - 羧乙基）膦盐酸盐（TCEP），足量的凝胶块，然后孵育沉浸件。这是留在56C水浴30分钟。
- 下一步的数码地面电视服务的解决办法是更换100μL500毫米，50％的乙腈溶液碳铵和凝胶，ammounium碳酸氢钠洗净切片。
- 洗涤液的吸气和200μL乙腈脱水凝胶。
- 乙腈然后取出100μL新鲜配制的100毫米碘乙酰胺的解决方案添加到烷基免费sulfhydryls。 25分钟室温在黑暗中进行这一步。
- 碘乙酰胺的解决办法是删除和凝胶块50毫米，碳铵50％乙腈（pH值8.0）2分钟与200μL洗涤，而震荡。重复此清洗步骤。
- 取出后洗涤液，凝胶块孵育200μL乙腈，这是当时被speedvac删除〜10分钟。
- 在这一步的凝胶块，胰蛋白酶消化的准备。凝胶片孵育30μL胰蛋白酶溶液（20毫微克/μL工作浓度），并置于冰上10分钟要肿凝胶。删除多余的胰蛋白酶是水合凝胶颗粒碳酸氢铵50毫米与30μL覆盖整个消化被允许在37C进行12至16小时，使他们沉浸。
- 五μL5％（V / V）甲酸加入到停用的胰蛋白酶和逮捕消化。
- 管振荡〜15分钟，离心，简单地把液体的试管底部，然后转移到一个干净的标记0.5毫升的小瓶。
- 下30μL0.1％（V / V）50％乙腈甲酸加入到凝胶块，所以他们只是受两次振荡10-15分钟，短暂离心分离。此步骤重复一次，更换步骤之间的甲酸乙腈。
- 最后的液体被删除，所有萃取液合并在一个单一的小瓶。 〜30 UL的speedvac体积减小。该样本是现在准备反相纳米液相色谱和质谱的蛋白质鉴定。在这个特定的例子中，这一步是开展orbi - 罗马和世界阱串联质谱仪从ThermoFisher（质量准确度，快速蛋白检测的占空比和一般健壮的操作系统功能选择），虽然其他型号和制造商的仪器可以很容易地描述到这一点的方法相结合。
- 现简要介绍了质谱分析的细节和标准。所有肽的分离反相纳米LC（Eksigent）和肽类加载到C18反相柱在3μL/ min的流速。流动相A为0.1％甲酸和2％的水乙腈，流动相B为0.1％甲酸的乙腈和20％的水。肽列在220 NL /分钟使用线性渐变从5％B级50％B级超过90分钟，然后到95％，超过5分钟乙的流速洗脱，最后5分钟保持恒定的95％乙。光谱获取数据依赖模式MS扫描和MS / MS扫描的LTQ使用Orbi陷阱。肽进行鉴定通过搜索对大鼠IPI数据库使用SEQUEST算法集成到Bioworks软件包v.3.53光谱。每个肽符合下列条件：XCorr≥2（1）≥3（2），≥4（3），和DeltaCN> 0.1。用于蛋白质鉴定的所有光谱手动检查，并没有接受蛋白质时不到二肽。只有蛋白质目前每四个P2X2下拉，在GST空下拉缺席被认为是为进一步分析。
图1。一个P2X2受体亚基的示意图 。 答 ：卡通说明一个P2X2受体亚基的拓扑结构。胞浆域由N和C末端。 P2X2受体（红色）的C -末端为诱饵拉下来检测 。P2X2受体在这项研究中所使用的C -末端氨基酸序列
图2。流程图和时间表达所使用的协议，净化，下拉和蛋白质的鉴定，我们显示该协议与时间线的轮廓。成年大鼠脑裂解准备新鲜立即拉下来分析前。
图3。 P2X2 C -末端在大鼠脑组织的网络二进制的蛋白质组学分析示意图 。P2X2受体的融合与消费税珠势必GST蛋白C -末端使用下拉检测。脑裂解液和培养固定的重组蛋白的蛋白质。裂解液洗不作承诺的分数。蛋白质质谱鉴定。
图4。鉴定P2X2受体的C -末端的具有约束力的合作伙伴。SYPRO染色凝胶，呈现出与C -末端的融合与GST（蓝色框）受体相互作用的假定蛋白质谱。商品及服务税单（黄色盒子）和谷胱甘肽琼脂糖珠单独控制车道也所示。箭头指示作进一步的分析质谱切除独特的乐队的例子。
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Discussion
离子通道是一个不可分割的膜蛋白的主要类。它们包含装满水的毛孔，选择性地允许跨质膜离子的运动了他们的电化学梯度。离子通道门打开和关闭状态之间。 P2X配体门控离子通道的情况下发射器（如ATP），或触发门控步骤是，它可能是由与其他蛋白的相互作用调节。在过去的十年见证在我们了解如何P2X受体结合ATP的13增加，但仍了解较少的辅助蛋白，在调节P2X功能方面的作用。在本议定书中所描述的方法是旨在确定P2X2受体的信号通过检查作为第一步的蛋白质与细胞内的C -末端相互作用形成的复合物。 P2X2受体信号复合体的一个完整的地图将提供急需的洞察到这些迷人的渠道病理生理。
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Acknowledgments
SW和烟草花叶病毒是在美国国立卫生研究院支持的NCRR和NHLBI。 BSK和HS是由美国国立卫生研究院的NINDS和NIGMS支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR international | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD Millipore | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR international | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros Organics | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 |
References
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