Summary
我々は、ATP依存性P2X2受容体の全長のC末端に結合する脳の蛋白質を識別するための単純なプロトコルを記述する。すべてのP2X受容体へのこのアプローチの拡張と体系的なアプリケーションは、P2X受容体シグナル伝達の理解につながることが期待される。
Abstract
リガンド依存性イオンチャネルは神経系1でシナプスのコミュニケーションを貫く。システインループ、グルタミン酸ゲートおよびP2X受容体チャネル2：哺乳類ではリガンド依存性チャネルの3つのファミリがあります。それぞれの場合に送信機の結合はイオンが電気化学的勾配を流れに経由する細孔の開口部につながる。多くのリガンド依存性チャネルは、またダウンストリームチャネルの開口部の持続時間を超える可能性の役割5（例えば、遺伝子の調節）をシグナリングしているカルシウムイオン3、4、に透過性である。したがって、リガンド依存性チャネルは、数ミリ秒から数日までの幅広い時間スケールで信号を送ることができる。これらの重要な役割を考えるとそれはそれ自体がタンパク質、そしてどのようにこれらのタンパク質は、シグナル伝達に調整できることで規制されている方法リガンド依存性イオンチャネルを理解する必要があります。最近の研究では、多くが、すべてではありませんが、チャンネルは蛋白質シグナル伝達複合体6の一部である可能性を示唆している。この記事では、P2X2受容体細胞質ドメインのC末端の側面に結合するタンパク質を同定する方法を説明します。
P2X受容体はATP依存性陽イオンチャネルであり、7つのサブユニット（P2X1 - P2X7）で構成されています。 P2X受容体は広く彼らは興奮性シナプス伝達や神経伝達物質放出7のシナプス前促通を媒介する脳、で表されます。 P2X受容体は興奮性および非興奮性細胞に存在し、神経細胞シグナリング、炎症と心血管機能8で重要な役割を仲介している。 P2X2受容体は神経系9に豊富であり、この研究の焦点です。各P2Xサブユニットは細胞外領域7と細胞内のNおよびC末端（図1a）7によって分離された二つの膜貫通セグメント（TM1＆TM2）を持つと考えられている。 P2Xサブユニット10は、（P2X1 - P2X7）アミノ酸レベル11で30〜50％の配列相同性を示す。 P2X受容体はイオンチャネル型受容体の中で最も単純な化学量論であるのみ3つのサブユニットが含まれています。 P2X2のC -末端は120アミノ酸（図1b）を構成され、P2X2受容体のシグナル伝達複合体の一部である可能性があるという仮説を支持する、いくつかのタンパク質のドッキングのコンセンサス部位が含まれています。いくつかの機能がP2X2受容体9のない研究のC -末端に起因しているが、しかし、全長C末端を介して、このタンパク質の細胞内側に結合する分子のパートナーを説明しました。この方法を本稿では、P2X2受容体の全長C末端と相互作用するタンパク質を同定するプロテオミクスアプローチを説明します。
Protocol
実験手順
実験手順（図2）は以下の段階的な方法で説明されている4つの部分から構成されています。
パート1：P2X2受容体のC末端のサブクローニングおよび発現。
我々はそれが結合する脳のタンパク質を同定するために全長細菌におけるP2X2受容体のC末端を表明している。
- P2X2受容体のC末端（残基353〜472）（図1）pGEX 4NT1（GEライフサイエンス）にクローン化と塩基配列決定と検証、PCRにより増幅した。
- 組換えプラスミドを大腸菌に形質転換された組換えタンパク質の発現用大腸菌（BL21）。
- P2X2 CT - GSTプラスミドを含む細菌（ 大腸菌 BL21）のグリセロールストックを滅菌ピペットの先端で擦り取り、適当な選択マーカーとルリア-ベルターニ（LB）培地（50 g / mlのアンピシリン）5mlに接種し、 37℃でオービタルシェーカーで一晩インキュベート。
- 600nmの光学密度に達するまで一晩培養したが、適切な抗生物質（50μg/ mlのアンピシリン）を含むLB培地250 mlに接種し、37℃で2〜3時間、250 rpmでオービタルシェーカーでインキュベートした〜 0.6から0.7。
- 培養は、1mMのIPTGで誘導し、さらにタンパク質発現のための3時間37℃でインキュベートした。
- 文化は、その後、4C（文化1mlのは、発現レベルを分析用に保存し、"誘導"としてラベル付けされた）で15分間5000gで回転させた。上清を捨て、ペレットを生理食塩水トリス- EDTA（STE）緩衝液（10mMトリス- HCl、150mMのNaCl、1mMのEDTA pH8.0）を20mlに再懸濁した。
- 懸濁液を50mlファルコンチューブに15分間5000gで回転させた。上清を捨て、半乾燥したペレットは、一晩、-70℃で凍結した。
- - 70Cペレットを氷冷溶解緩衝液40ml中（2％（w / v）のサルコシル、15 mgのリゾチーム、150mMのNaCl、50mMのトリスpH7.5、5mMのDTTと完全なプロテアーゼ阻害剤の錠剤）に再懸濁し、 、および懸濁液を氷上で30分間インキュベートした。このインキュベーションの間、3ミリリットルグルタチオン - セファロース4BビーズをPBSに続いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、20mlのT - PBS（0.1％（v / v）のPBSでtritonX - 100）20mlで洗浄した。ビーズを1mlのPBSに再懸濁させた。
- 細菌懸濁液は、液体窒素と超音波処理で3回凍結融解（オフ/オン1秒、氷上で3分間30ミクロン）と、さらに4％（v / v）のトリトンX - 100、10mMのマグネシウムと30分間インキュベートした。氷上で4と2 mMのATP。
- ライセートは、4Cとペレットで15分を20000 gで遠心し（上清のペレットと1 mlのサンプルが細胞質ゾルと膜中のタンパク質の量をテストするためにSDSのページ用に保存された）を廃棄した。上清を4℃で1時間（または一晩）のためのビーズとインキュベートした。
- ビーズを5分間、500gで遠心した上清を（サンプルの非結合画分のために保存された）を廃棄した。ビーズをT - PBSに5回（洗浄は洗浄のコントロールのために保存された）で洗浄した。
- ビーズを50％（w / v）のスラリーを得たPBSに再懸濁し、使用まで4℃で冷蔵庫に保存されていました。タンパク質濃度はBradfordアッセイ（製造者の指示当たり）によって推定された。
第2部：全脳ライセートの調製
P2X2受容体が豊富に脳8で表されることが知られている。本解析では、我々は、ラットの全脳溶解（図3）から、P2X2受容体と相互作用するタンパク質を特定しようとした。
- 成体ラットの脳を採取（動物はUCLA IAACUC承認されたプロトコルに従って、実験動物の管理と使用に関するNIHのガイドに従って屠殺し）し、直ちに氷冷PBS（3X）を洗浄した。
- 150mMのNaClを含有する氷冷溶解バッファーのセル10ミリリットル（収穫脳の〜5倍の湿重量）を溶解するために、50mMトリス- HCl、pH7.4の、10mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのNaFを、1mMののNa 3 VO 4、1mMのPMSF、ロイペプチン、5μg/ mlの、1％（v / v）のNP - 40、およびプロテアーゼインヒビターカクテル錠を収穫し、脳に追加された。
- 均質な一貫性の混合が達成されるまで脳組織をガラスDounceホモジナイザーで氷の上均質化した。
- 細胞溶解液は、連続したセルを削除するには、5分間に2000 gで回転させた。上清はそのまま細胞小器官と細胞膜の凝集物を除去するために60分間29000グラムで再び採取し、分離独立しました。
- すぐに遠心分離後上清を新しいチューブに移した。全脳のライセートのタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより測定した（通常〜15 mg / mlの）。
- ライセートを分取し、AT - 70Cで保存した。
パート3：P2X2 C -テイル関連したタンパク質の単離
全脳ライセートからP2X2 CT - GSTの結合パートナーを同定するために、アッセイのプルダウンは、CT - Gを用いて実施したSTは、餌としてグルタチオンセファロース4Bビーズに固定化。コントロールについては、ビーズに結合しただけではGSTが使用されました。
- 脳ライセートを4℃で1時間、GSTビーズとpreclearedした。ペレットを廃棄した上清を更なる分析のために使用されていました。
- グルタチオンセファロース4 Bのビーズに結合したGSTとP2X2 CT - GST（10μg）を等量のLysis Buffer中で4℃で回転して、ラットの全脳のライセートからprecleared可溶化タンパク質を100gで一晩インキュベートした。
- ビーズは5分間1000gで遠心した上清を捨てた。
- ビーズを溶解緩衝液で一回洗浄し、修正Laemliバッファーで煮沸された[4％（w / v）のSDS、10％（v / v）の2 - メルカプトエタノール、2％（v / v）グリセロール、0.004％（W / V）ブロモフェノールブルーおよび0.125 M TrisCl pHを6.8] 5分間。
- サンプルは、5分間5000gで遠心し上清は、（図4）10％SDS - PAGEにより分離した。ゲルを染色SYPROルビータンパク質ゲルを染色（製造元の指示に従って）と紫外線下で可視化した。 P2X2 CT -関連タンパク質を餌としてGST - nullを使用して回復したものと比較した。四生物学的には（四脳およびつの独立したプルダウンをすなわち）が実行された複製。
パート4：タンパク質の同定。
ゲル電気泳動により分離されたタンパク質をゲルから切り出し、質量分析12で同定された（注）。過程を通して粉塵がない場合は、ケラチン汚染を減らすために重要です。実験者は、常時、ヘアネット、手袋を顔のマスクを着用し、手袋を使用することなく関心のゲル地区には決して手を触れないようにしてください。
- ダウンP2X2プルダウンから回収されたすべての可視タンパク質バンドは、きれいなカミソリの刃とさいの目に切られた（図4）を摘出した。 GST -ヌルのゲルの対応する領域は、車線プルダウンものレベルより下のタンパク質のその存在を保証するためにバンドの染色（GST - nullの餌のための特異的なバンドがまた摘出したと確認された）に関係なく同じ方法で摘出染色感度は見逃していなかった。
- ゲル片を200 50％50 mM重炭酸アンモニウムの溶液（v / v）のアセトニトリル（ACN）と室温で15分間ボルテックスチューブをインキュベートした。この洗浄ステップを繰り返します。
- ゲル片は、200μlのアセトニトリル（ゲル片が縮小し、色で不透明になるはず）を追加することにより脱水した。
- Acetontrileは削除され、ゲル片は、約10分間speedvacで乾燥させた。
- ゲル片はその後、新たに調製した10mMのDTT/10 mMトリス（2 - カルボキシ - エチル）ピースを浸漬するのに十分な量のホスフィン塩酸塩（TCEP）の30μlのでインキュベートした。これは、56C水浴で30分間放置した。
- 次のDTT溶液を50％アセトニトリル溶液とammounium炭酸で洗浄ゲルスライスに100μlの500 mM重炭酸アンモニウムに置き換えられました。
- 洗浄溶液を吸引し、アセトニトリル200μlのは、ゲルを脱水に追加されました。
- アセトニトリルを除去し、100μlを調製したばかりの100mMヨードアセトアミドのソリューションは、フリースルフヒドリルをアルキル化するために追加されました。このステップでは、暗所で室温で25分間進めた。
- ヨードアセトアミド溶液を除去し、ボルテックスしながらゲル片は、2分間50％acetontrile液（pH8.0）に50 mM重炭酸アンモニウム200μlで洗浄した。この洗浄工程を繰り返した。
- 洗浄溶液を除去した後、ゲル片を〜10分間speedvacによって削除された200μlのアセトニトリルと共にインキュベートした。
- このステップでゲル片は、トリプシン消化のための準備が整いました。ゲル片を30μlのトリプシン溶液（20 ng /μLのワーキング濃度）中でインキュベートしても腫れするゲルのための10分間氷上に置いた。過剰トリプシンは37℃で12〜16時間進行させた彼らが消化を通して浸漬保つために50mMの重炭酸アンモニウムと30μlのを重ねてゲル粒子を除去し、再水和した。
- 五の5％溶液（v / v）のギ酸はトリプシンと逮捕消化を無効にするには追加されます。
- チューブは〜15分間攪拌し、きれいと標識0.5mlのバイアルに移していたチューブの底に液体をもたらすために簡単に遠心分離した。
- それらはちょうど簡単な遠心分離によって分離、10〜15分間2回ボルテックスで続いてカバーされたので、50％アセトニトリル中0.1％の次の30μL（v / v）のギ酸はゲル片に追加されました。このステップは、ステップ間のギ酸 - アセトニトリルを置き換えて、一回繰り返した。
- 最終的な液体は、単一バイアルで除去し、すべての抽出溶液は、混合した。このボリュームはspeedvacで〜30 ULに減少した。サンプルは現在、逆相質量分析法によるナノ液体クロマトグラフィーと蛋白質の同定のための準備ができていた。この特定の例では、このステップはThermoFからOrbiトラップタンデム質量分析計で実施され他のモデルとメーカーの楽器は簡単にこれまでに説明したアプローチと相まってすることができるがisher（その高質量精度、タンパク質の検出と一般的に堅牢なオペレーティング機能のための高速なデューティサイクルのために選択）、。
- 質量分析の詳細と基準について簡単に紹介されています。すべてのペプチドは逆相ナノLC（Eksigent）によって分離し、ペプチドを3μL/ minの流量でC18逆相カラム上に負荷された。移動相0.1％ギ酸と水で2％ACNでした、移動相Bは0.1％ギ酸とACNで20％の水である。ペプチドは、220 NL / minは5分以上95％Bにして、90分間にわたって50％Bに5％のBからの線形グラデーションを使用しての流速でカラムから溶出させ、そして最終的に5分間一定の95％Bを保っていた。スペクトルは、MS / MSスキャンのMSのスキャンとLTQに使用Orbiトラップとデータ依存モードで獲得されました。ペプチドはBioworksのソフトウェアパッケージに統合SEQUESTのアルゴリズムを用いてラットIPIのデータベースv.3.53に対してスペクトルを検索することによって同定された。 xcorrは≥2（+1）、≥3（+2）、≥4（+3）、およびDeltaCN> 0.1：それぞれのペプチドは、以下の基準を満たしていた。タンパク質同定のために使用される全てのスペクトルは、手動で検査し、以下の二つのペプチドが同定されたときにタンパク質が受け入れられなかった。唯一のタンパク質はGST -ヌルプルダウン中に4 P2X2プルダウンのそれぞれと欠席以下の提示は、さらなる分析のために考慮された。
図1。 P2X2受容体のサブユニットの模式図。 A.漫画は、P2X2受容体のサブユニットのトポロジを示します。細胞質ドメインはNおよびC末端で構成されています。 P2X2受容体（赤）のC末端は、アッセイをプルダウンするための餌として使用した。本研究で使用したP2X2受容体C末端のB.アミノ酸配列は。
図2。発現、精製に使用されるプロトコルのフローチャートとタイムライン、プルダウンし、タンパク質の同定。我々は、タイムラインとプロトコルの概要を示す。成体ラット脳ライセートはアッセイプルダウンに使用する直前に新しく調製した。
図3。ラット脳におけるP2X2 C末端ネットワークのバイナリプロテオーム解析の模式図。GSTビーズに結合したGST蛋白質と融合させたP2X2受容体のC末端は、アッセイをプルダウンするために使用されました。脳ライセートを調製し、タンパク質は固定化した組換えタンパク質とインキュベートした。非結合画分を溶解緩衝液で洗浄した。タンパク質は、質量分析により同定した。
図4。P2X2受容体のC末端の結合パートナーの識別。GST（青い箱）と融合受容体のC末端と相互作用推定タンパク質のスペクトルを示すSYPRO染色したゲル。単独でGST単独（黄色のボックス）とグルタチオンセファロースビーズ用コントロールレーンも表示されます。矢印は質量分析によって、さらなる分析のために摘出しユニークなバンドの例を示している。
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Discussion
イオンチャネルは、膜内在性タンパク質の主要なクラスです。彼らは選択的に形質膜を横断し、その電気化学的勾配下にイオンの移動を可能にする水の満たされた気孔が含まれています。開いた状態および閉じた状態との間のイオンチャネルのゲート。ゲーティングのステップは、P2Xリガンド依存性イオンチャネルの場合の送信機（例：ATP）によって引き起こされる、またはそれが他のタンパク質との相互作用により調節されることがあります。この10年間は、P2X受容体はATP 13に結合する方法についての我々の理解の増加を目撃していますが、P2X機能を調節するのに補助的なタンパク質の役割はあまりよく理解されたまま。このプロトコールに記載されているアプローチは、（最初のステップとして）細胞内のC -末端と相互作用するタンパク質を調べることによって、P2X2受容体によって形成されるシグナル伝達複合体を識別するために設計されています。 P2X2受容体シグナル伝達複合体の完全なマップは、これらの魅力的なチャネルの病態生理に多くの必要な洞察を提供します。
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Acknowledgments
SWとTMVは、国立衛生研究所のNCRRとNHLBIでサポートされています。 BSKとHSは、国立衛生研究所のNINDSとNIGMSでサポートされています。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR international | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD Millipore | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR international | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros Organics | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 |
References
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