Summary
Se describe un protocolo simple de identificar a las proteínas del cerebro que se unen a la terminal C de longitud completa de la ATP-dependientes P2X2 receptores. La extensión y aplicación sistemática de este enfoque a todos los receptores P2X se espera que conduzca a una mejor comprensión de la señalización del receptor P2X.
Abstract
Ligando la base de los canales iónicos de comunicación sináptica en el sistema nervioso 1. En los mamíferos hay tres familias de ligandos de canales: el lazo cys, el glutamato y los canales de los receptores P2X 2. En cada caso, la unión de emisor lleva a la apertura de un poro por donde fluyen los iones de sus gradientes electroquímicos. Muchos ligando los canales también son permeables a los iones de calcio 3, 4, que tienen funciones de señalización hacia abajo 5 (por ejemplo, la regulación de genes) que pueden superar la duración de la apertura del canal. Así, ligando los canales pueden ser señal en escalas de tiempo amplio que van desde unos pocos milisegundos a días. Teniendo en cuenta estas importantes funciones, es necesario entender cómo ligando los canales iónicos se están reguladas por las proteínas, y cómo estas proteínas pueden sintonizar señales. Estudios recientes sugieren que muchos, si no todos, los canales pueden ser parte de complejos de proteínas de señalización 6. En este artículo se explica cómo identificar las proteínas que se unen a los aspectos C-terminal del dominio del receptor P2X2 citosólica.
Receptores P2X ATP-dependientes canales de cationes y constará de siete subunidades (P2X1-P2X7). Receptores P2X se expresan ampliamente en el cerebro, donde median la transmisión sináptica excitatoria y la facilitación presináptica de la liberación de neurotransmisores 7. Receptores P2X se encuentran en las células excitables y no excitables y mediar un papel clave en la señalización neuronal, la inflamación y la función cardiovascular 8. P2X2 receptores son abundantes en el sistema nervioso 9 y son el foco de este estudio. Cada subunidad P2X se cree que tiene dos segmentos que atraviesan la membrana (TM1 y TM2), separadas por una región extracelular intracelular 7 y N y C terminales (Fig. 1a) 7. Subunidades P2X 10 (P2X1-P2X7) muestran un 30-50% de homología de secuencia en el nivel de aminoácidos 11. Receptores P2X contienen sólo tres subunidades, que es el más simple estequiometría entre los receptores ionotrópicos. El P2X2 C-terminal consta de 120 aminoácidos (Figura 1b) y contiene varias proteínas consenso sitios de atraque, que apoya la hipótesis de que P2X2 receptor puede ser parte de complejos de señalización. Sin embargo, a pesar de varias funciones han sido atribuidas a la C-terminal de los receptores P2X2 nueve ningún estudio ha descrito los socios molecular que se acoplan a la parte intracelular de esta proteína a través de toda la longitud C-terminal. En este artículo se describen los métodos de una aproximación proteómica para identificar las proteínas que interactúan con el cuerpo entero C-terminal de los receptores P2X2.
Protocol
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
El procedimiento experimental (Fig. 2) consta de cuatro partes que se describen de una manera gradual a continuación.
Parte 1: Subclonación y la expresión de la C-terminal de los receptores P2X2.
Hemos expresado la longitud C-terminal de los receptores P2X2 en las bacterias para identificar las proteínas del cerebro al que se une.
- El C-terminal (residuos 353-472) de los receptores P2X2 (Fig. 1) fue amplificado por PCR, clonado en pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) y se verificó con la secuenciación.
- El plásmido recombinante se transformó en E. Coli (BL21) para la expresión de proteínas recombinantes.
- Stocks de glicerol de bacterias (E. coli BL21) que contiene el P2X2 CT-GST plásmido se raspa con una punta de pipeta estéril y se inoculó en 5 ml de medio Luria-Bertani (LB) los medios de comunicación con el marcador adecuado selectiva (50 g / ml ampicilina) y incubaron durante la noche en un agitador orbital a 37 º C.
- Las culturas crecido durante la noche se inocularon en 250 ml de medio LB con los antibióticos adecuados (50 mg / ml ampicilina) y se incubaron en un agitador orbital a 250 rpm durante 2-3 horas a 37 º C hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó ~ 0.6-0.7.
- La cultura fue inducida con 1 mM de IPTG y se incubaron a 37 º C durante 3 horas para la expresión de la proteína.
- La cultura se separó luego a 5000 g durante 15 min a 4 ° C (1 ml de la cultura se ha guardado para analizar el nivel de expresión y etiquetados como "inducida"). Sobrenadante fue descartado y el pellet se resuspendió en 20 ml de solución salina de Tris-EDTA (STE) buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0).
- La suspensión se centrifugó a 5000 g durante 15 minutos en un tubo Falcon de 50 ml. El sobrenadante fue descartado y el pellet semi-seco se congeló a-70C durante la noche.
- El-70C se resuspendió en 40 ml de solución amortiguadora de lisis fría (2% (w / v) sarkosyl, 15 mg de lisozima, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM de TDT y la tableta completa inhibidor de la proteasa) , y la suspensión se incubó en hielo durante 30 min. Durante la incubación, 3 ml de glutatión-Sepharosa 4B cuentas se lavaron con 20 ml de tampón fosfato salino (PBS) y 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) TritonX-100 en PBS), seguido por PBS. Las cuentas se resuspendieron en 1 ml de PBS.
- La suspensión bacteriana se congelarse y descongelarse 3 veces en nitrógeno líquido y se sonica (1s de encendido / apagado de 30 micrones de tres minutos sobre el hielo) y se incubaron durante 30 minutos con un 4% (v / v) de Triton X-100, 10 mM MgSO 4 y 2 mM ATP en el hielo.
- El lisado se centrifugó a 20.000 g durante 15 min a 4 ° C y el precipitado se descartó (una muestra de pellet y 1 ml de sobrenadante se guardó para SDS-PAGE para comprobar las cantidades de proteínas en el citosol y las membranas). El sobrenadante se incubó con las cuentas de una hora (o toda la noche) a 4 ° C.
- Las bolas se giró a 500 g por 5 min y se descartó el sobrenadante (muestra se salvó de fracción libre). Las bolas se lavaron con PBS-T en cinco ocasiones (lavados se salvaron de los controles de lavado).
- Las cuentas se resuspendieron en PBS a dar el 50% (w / v) los purines y se almacena en el refrigerador a 4 º C hasta su uso. La concentración de proteínas se estimó por el ensayo de Bradford (siguiendo las instrucciones del fabricante).
Parte 2: Preparación de los lisados de todo el cerebro
P2X2 receptores son conocidos por ser altamente expresado en el cerebro 8. En el presente análisis, hemos tratado de identificar las proteínas que interactúan con los receptores P2X2 a partir de lisados de cerebro de rata entera (Fig. 3).
- Cerebro de rata adulta fue cosechada (animales fueron sacrificados de acuerdo con un IAACUC UCLA-protocolo aprobado y de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio) y aclararán inmediatamente helada PBS (3 veces).
- Para lisar las células de 10 ml (~ 5 veces el peso húmedo del cerebro cosecha) de tampón de lisis helada que contiene 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 5 mg / ml de leupeptina, 1% (v / v) NP-40, y una tableta de inhibidor de la proteasa cóctel fue introducido en el cerebro cosechado.
- El tejido cerebral se homogeneizó en el hielo con un homogeneizador de vidrio Dounce hasta obtener una mezcla de consistencia homogénea se logró.
- Lisado celular se centrifugó a 2000 g durante 5 minutos para eliminar las células sin romper. El sobrenadante se recogió y se volvió de nuevo a 29.000 g durante 60 minutos para eliminar orgánulos intactos y agregados de la membrana.
- Inmediatamente después de la centrifugación, el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio. La concentración de proteínas del lisado de todo el cerebro se midió por el ensayo de Bradford (normalmente ~ 15 mg / ml).
- El lisado se dividió en alícuotas y se almacenaron a-70C.
Parte 3: Aislamiento de P2X2 C-cola proteínas asociadas
Para identificar a los socios de unión de P2X2 CT-GST a partir de lisados de todo el cerebro, un desplegable ensayo se realizó mediante el uso de CT-GST inmovilizado en glutatión sefarosa 4B cuentas como cebo. Para los controles, solo GST unida a las microesferas se utilizó.
- Cerebro lisado se precleared con cuentas de IVA durante 1 hora a 4C. El sedimento se desechó y el sobrenadante se utilizó para otros análisis.
- Igual cantidad de GST y P2X2 CT-GST (10 mg) con destino a glutatión sefarosa 4 cuentas B se incubaron durante la noche con 100 g de proteínas precleared solubilizados lisado de cerebro de rata entera, con la rotación a 4 º C en el tampón de lisis.
- Las cuentas se hace girar a 1000 g por 5 min y el sobrenadante fue descartado.
- Las bolas se lavaron una vez con el tampón de lisis y se hierve en modificar Laemli buffer [4% (w / v) SDS, 10% (v / v) 2-mercaptoetanol, 2% (v / v) de glicerol, 0,004% (w / v) azul de bromofenol y 0,125 M pH 6,8 TrisCl] durante 5 min.
- Las muestras se centrifugaron a 5000 g por 5 min y el sobrenadante se separó en un 10% SDS-PAGE (Fig. 4). Los geles fueron teñidos con gel de proteínas SYPRO Rubí mancha (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y se visualizaron bajo luz ultravioleta. P2X2 CT proteínas asociadas fueron comparados con los recuperados utilizando GST de cero como cebo. Cuatro réplicas biológicas fueron realizadas (es decir, cuatro cerebros y cuatro bajas tirar independiente).
Parte 4: Identificación de proteínas.
Proteínas separadas por electroforesis en gel fueron extirpados del gel y se identifican por espectrometría de masas 12. Nota: la ausencia de polvo durante todo el proceso es fundamental para reducir la contaminación de la queratina. El experimentador debe usar una mascarilla, red para el cabello y guantes en todo momento y nunca toque la región de gel de interés sin el uso de guantes.
- Todas las bandas de proteínas visible recuperado de la fuerza por P2X2 fueron extirpados con una cuchilla limpia y cortada en cubitos (Fig. 4). Regiones correspondientes del gel en la GST-pull nula por el carril también fueron extirpados de la misma manera sin tener en cuenta a las manchas de banda (bandas específicas para el cebo de GST-nulos fueron extirpados también e identificados), para asegurar que la presencia de proteínas por debajo del nivel de sensibilidad de la tinción no se ha perdido.
- Las piezas de gel se incubaron con 200 l de bicarbonato amónico 50 mM en el 50% (v / v) acetonitrilo (ACN) y los tubos vortex durante 15 min a temperatura ambiente. Repita este paso de lavado.
- Las piezas de gel se deshidrata mediante la adición de 200 l de acetonitrilo (piezas de gel se encogen y se vuelven opacas en color).
- Acetontrile fue removido y las piezas de gel se seca en un speedvac de ~ 10 min.
- Las piezas de gel fueron incubadas con 30 l de la recién preparada 10 mM Tris DTT/10 mM (2-carboxi-etil) clorhidrato de fosfina (TCEP) de un volumen suficiente para sumergir las piezas. Esto se dejó durante 30 minutos a baño de agua 56C.
- A continuación la solución de DTT fue reemplazado con 100 l de bicarbonato de amonio 500 mM en una solución de acetonitrilo al 50% y las rodajas de gel se lavó con bicarbonato ammounium.
- La solución de lavado fue aspirado y 200 l de acetonitrilo añadido a la deshidratación de los geles.
- Acetonitrilo fue eliminado y 100 l recién preparada una solución de 100 mM yodoacetamida se añadió para alquilar sulfhidrilos libres. Este paso procedió durante 25 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Solución de yodoacetamida fue removido y las piezas de gel se lavaron con 200 l de bicarbonato amónico 50 mM en el 50% acetontrile (pH 8,0) durante 2 minutos, mientras agitación. Esta etapa de lavado se repitió.
- Después de retirar la solución de lavado, las piezas de gel se incubaron con 200 l de acetonitrilo que se eliminó por speedvac de ~ 10 minutos.
- En este paso las piezas de gel está listo para la digestión de tripsina. Piezas de gel se incubaron en 30 l de solución de tripsina (20 ng / l de concentración de trabajo) y se coloca en hielo durante 10 minutos para los geles de estar bien hinchado. Tripsina en exceso se eliminó y se rehidrata partículas de gel recubierto con 30 ml con bicarbonato amónico 50 mM para mantenerlos sumergidos a lo largo de la digestión que se le permitió continuar por 12 a 16 horas a 37 º C.
- L Cinco de 5% (v / v) de ácido fórmico se añade a desactivar la digestión de la tripsina y la detención.
- Los tubos se agitaron durante aproximadamente 15 min y se centrifuga brevemente para llevar el líquido a la parte inferior del tubo, que fue trasladado a un ml frasco limpio y etiquetado 0.5.
- Próximos 30 l de 0,1% (v / v) de ácido fórmico en el 50% de acetonitrilo se añadió a piezas de gel por lo que fueron cubiertos solo dos veces seguido por agitación durante 10-15 minutos, separados por centrifugación breve. Este paso se repitió una vez, en sustitución del ácido fórmico y acetonitrilo entre los pasos.
- El líquido final fue eliminado y se combinan todas las solución de extracción en un solo vial. Este volumen se redujo a aproximadamente 30 uL en el speedvac. La muestra estaba listo para la fase inversa nano-cromatografía líquida y la identificación de proteínas por espectrometría de masas. En este ejemplo concreto, este paso se lleva a cabo en un espectrómetro de masas en tándem Orbi-trampa de ThermoFclasificador (elegido por su alta precisión la masa, el ciclo de trabajo rápido para la detección de las proteínas y las características de funcionamiento en general robusta), aunque otros modelos e instrumentos de los fabricantes podría ser, junto con el enfoque descrito en este punto.
- Los detalles y los criterios de análisis de espectrometría de masas son ahora una breve presentación. Todos los péptidos fueron separados de fase inversa nano-LC (Eksigent) y los péptidos fueron cargados en un C18 columna de fase inversa, con un caudal de 3 l / min. Una fase móvil fue de 0,1% de ácido fórmico y 2% de ACN en el agua; B de la fase móvil fue de 0,1% de ácido fórmico y el 20% de agua en ACN. Los péptidos se eluyeron de la columna a un flujo de 220 nl / min con un gradiente lineal de B un 5% a 50% de B durante 90 minutos, y luego a 95% de B durante 5 min y, finalmente, manteniendo constante B del 95% durante 5 minutos . Los espectros fueron adquiridos en los datos de modo dependiente de la Orbi-trampa que se utiliza para los análisis de MS y LTQ de MS / MS análisis. Los péptidos fueron identificados por búsquedas en los espectros de la base de datos de ratas IPI v.3.53 utilizando el algoritmo SEQUEST integrado en el paquete de software BioWorks. Cada péptido se reunieron los siguientes criterios: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (2), ≥ 4 (3), y DeltaCN> 0.1. Todos los espectros utilizados para la identificación de proteínas fueron inspeccionados de forma manual y no las proteínas aceptada cuando menos de dos péptidos fueron identificados. Sólo las proteínas presentes tras cada uno de los cuatro P2X2 bajas tirar y tirar ausente durante bajadas GST-fueron considerados nulos para otros análisis.
Figura 1. Representación esquemática de una subunidad del receptor P2X2. A. La caricatura muestra la topología de una subunidad del receptor P2X2. El dominio citosólico se compone de N y C terminales. El C-terminal de P2X2 receptor (rojo) se utiliza como cebo para tirar hacia abajo del ensayo. B. secuencia de aminoácidos del receptor P2X2 C-terminal utilizado en este estudio.
Figura 2. Diagrama de flujo y la línea de tiempo del protocolo usado para la expresión, purificación, tira hacia abajo y la identificación de las proteínas. Mostramos el esquema del protocolo con la línea de tiempo. Rata adulta lisado cerebro estaba preparado fresco inmediatamente antes del uso de la fuerza hacia abajo ensayos.
Figura 3. Representación esquemática de los análisis proteómicos de binarios P2X2 C-terminal de la red en el cerebro de la rata. El C-terminal de los receptores P2X2 fusionada con la proteína GST unida a las microesferas GST fue utilizado para tirar hacia abajo los ensayos. Cerebro lisado fue preparado y las proteínas se incubaron con las proteínas recombinantes inmovilizado. Fracción libre se lavó con el tampón de lisis. Se identificaron las proteínas por espectrometría de masas.
Figura 4. Identificación de los socios de la unión del C-terminal de los receptores P2X2. Gel Sypro manchado muestra un espectro de proteínas putativo que interactúan con el C-terminal de los receptores de fusión con GST (caja azul). Carriles de los controles de GST sola (recuadro amarillo) y cuentas de glutatión sefarosa solo se muestran también. Las flechas indican ejemplos de bandas únicas que fueron extirpados para su posterior análisis por espectrometría de masas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los canales iónicos son una clase importante de proteínas integrales de membrana. Que contienen poros llenos de agua que permiten selectivamente el movimiento de iones por sus gradientes electroquímicos a través de la membrana plasmática. Los canales iónicos puerta entre abierta y cerrada de los estados. El paso de disparo es activado por los transmisores (por ejemplo, ATP) en el caso de los canales iónicos P2X ligando, o puede ser regulada por las interacciones con otras proteínas. La última década ha sido testigo de un aumento en nuestra comprensión de cómo los receptores P2X se unen ATP 13, pero el papel de las proteínas accesorias en la regulación de la función P2X sigue siendo menos conocido. El método descrito en este protocolo está diseñado para identificar los complejos de señalización formado por los receptores P2X2 examinando (como un primer paso) las proteínas que interactúan con el C-terminal intracelular. Un mapa completo del complejo de receptores P2X2 señalización proporcionará información muy necesaria sobre la fisiopatología de estos canales fascinante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
SW y TMV son apoyados por la CNRR y el NHLBI en los Institutos Nacionales de Salud. BSK SA y son apoyados por el NINDS y NIGMS de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR international | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD Millipore | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR international | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros Organics | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 |
References
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).
- Burnashev, N. Calcium permeability of ligand-gated channels. Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Khakh, B. S., North, R. A. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease. Nature. 442, 527-532 (2006).
- Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding. J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).
- Khakh, B. S. International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits. Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).
- Young, M. T. Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy. J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).
- Edmondson, R. D. Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS. Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).
- Evans, R. J. Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors. Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).
