Summary
Nous décrivons un protocole simple pour identifier les protéines du cerveau qui se lient à l'extrémité C-terminale pleine longueur de l'ATP-dépendants P2X2 récepteurs. L'extension et l'application systématique de cette approche à tous les récepteurs P2X devrait conduire à une meilleure compréhension de la signalisation des récepteurs P2X.
Abstract
Canaux ioniques ligand-dépendants sous-tendent la communication synaptique dans le système nerveux 1. Chez les mammifères, il existe trois familles de canaux ligand-dépendants: la boucle Cys, le glutamate-dépendants et les canaux récepteurs P2X 2. Dans chaque cas de liaison de l'émetteur conduit à l'ouverture d'un pore à travers lequel les ions couler leurs gradients électrochimiques. Beaucoup de canaux ligand-dépendants sont aussi perméables aux ions calcium 3, 4, qui ont des rôles de signalisation en aval 5 (régulation des gènes par exemple) qui peut dépasser la durée d'ouverture des canaux. Ainsi canaux ligand-dépendants peuvent signal sur des échelles de temps allant de larges quelques millisecondes à quelques jours. Compte tenu de ces rôles importants, il est nécessaire de comprendre comment ligand-mêmes canaux ioniques sont régulés par des protéines, et comment ces protéines peuvent syntoniser la signalisation. Des études récentes suggèrent que beaucoup, sinon toutes, les chaînes peuvent faire partie des complexes de protéines de signalisation 6. Dans cet article, nous expliquons comment identifier les protéines qui se lient à des aspects C-terminale du domaine P2X2 récepteur cytosolique.
Récepteurs P2X sont des canaux cationiques ATP-dépendants et se compose de sept sous-unités (P2X1-P2X7). Récepteurs P2X sont largement exprimés dans le cerveau, où ils servent de médiateurs excitateurs transmission synaptique et la facilitation présynaptique de libération des neurotransmetteurs 7. Récepteurs P2X sont trouvés dans les cellules excitables et non excitables et arbitrer un rôle clé dans la signalisation neuronale, l'inflammation et la fonction cardiovasculaire 8. P2X2 récepteurs sont abondants dans le système nerveux 9 et font l'objet de cette étude. Chaque sous-unité P2X est censé posséder deux segments transmembranaires (TM1 et TM2) séparés par une région extracellulaire et intracellulaire 7 N et C terminales (figure 1a) 7. Sous-unités P2X 10 (P2X1-P2X7) montrent une homologie de séquence de 30-50% au niveau des acides aminés 11. Récepteurs P2X contenir que trois sous-unités, qui est la plus simple parmi les récepteurs ionotropiques stoechiométrie. Le P2X2 C-terminale composée de 120 acides aminés (Fig 1b) et contient plusieurs sites d'accueil pour des protéines de consensus, soutenant l'hypothèse que des récepteurs P2X2 peut-être partie des complexes de signalisation. Cependant, bien que plusieurs fonctions ont été attribuées à l'extrémité C-terminale des récepteurs P2X2 9 aucune étude n'a décrit les partenaires moléculaires qui se couplent à la face intracellulaire de cette protéine par l'intermédiaire de la longueur totale C-terminale. Dans cet article, nous décrivons les méthodes d'une approche protéomique pour identifier les protéines qui interagissent avec la pleine longueur C-terminale de P2X2 récepteurs.
Protocol
Procédures expérimentales
La procédure expérimentale (Fig. 2) se compose de quatre parties qui sont décrits d'une manière graduelle ci-dessous.
Partie 1: Sous-clonage et l'expression de la partie C-terminale du récepteur P2X2.
Nous avons exprimé toute la longueur C-terminale de P2X2 récepteurs dans des bactéries pour identifier les protéines du cerveau à laquelle il se lie.
- Le C-terminale (résidus 353 à 472) du récepteur P2X2 (Fig 1) a été amplifié par PCR, clonées dans pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) et vérifiées avec le séquençage.
- Le plasmide recombinant a été transformé en E. Coli (BL21) pour l'expression de protéines recombinantes.
- Stocks de glycérol de bactéries (E. coli BL21) contenant le CT-P2X2 TPS plasmides ont été grattées avec une pipette stérile et inoculé dans 5 ml de milieu Luria-Bertani (LB) des médias avec un marqueur sélectif approprié (50 g / ml d'ampicilline) et incubée pendant une nuit dans un agitateur orbital à 37C.
- Les cultures ont été inoculées cultivées pendant une nuit dans 250 ml de milieu LB avec un antibiotique approprié (50 pg / ml d'ampicilline) et incubées dans un agitateur orbital à 250 rpm pendant 2-3 heures à 37 ° C jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteint ~ 0,6 au 0,7.
- La culture a été induite avec 1 mM d'IPTG et encore incubées à 37 ° C pendant 3 heures pour l'expression protéique.
- La culture a été ensuite centrifugé à 5000 g pendant 15 min à 4 ° C (1ml de la culture a été sauvé pour analyser le niveau d'expression et étiquetés comme «induite»). Le surnageant a été jeté et le culot a été resuspendu dans 20 ml de solution saline Tris-EDTA (STE) tampon (10 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM pH 8,0).
- La suspension a été centrifugé à 5000 g pendant 15 min dans un tube Falcon de 50 ml. Le surnageant est écarté et le culot semi-sec a été congelée à-70C la nuit.
- Le 70C-culot a été resuspendu dans 40 ml de tampon de lyse glacée (2% (p / v) sarkosyl, 15 mg de lysozyme, NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH 7,5, 5 mM de DTT et complète comprimé d'inhibiteur de protéase) , et la suspension a été incubé sur glace pendant 30 min. Pendant cette incubation, 3 ml de glutathion-Sépharose 4B perles ont été lavées avec 20 ml de tampon phosphate salin (PBS) et 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) TritonX-100 dans le PBS), suivie par PBS. Les perles ont été remises en suspension dans 1 ml de PBS.
- La suspension bactérienne a été congelé-décongelé 3 fois dans de l'azote liquide et soniqué (1s on / off, 30 microns pendant 3 min sur la glace) et encore incubées pendant 30 min à 4% (v / v) de Triton X-100, 10 mM de MgSO 4 et 2 mM d'ATP sur la glace.
- Le lysat a été centrifugé à 20000 g pendant 15 min à 4 ° C et de culot a été mis au rebut (un échantillon de granulés et 1 ml de surnageant a été sauvé par SDS-PAGE de tester les quantités de protéines dans le cytosol et les membranes). Le surnageant a été incubé avec les billes pendant 1 heure (ou une nuit) à 4C.
- Les perles ont été centrifugés à 500 g pendant 5 min et le surnageant a été éliminé (échantillon a été sauvé de la fraction non liée). Les billes ont été lavées avec du PBS-T à cinq reprises (lavages ont été enregistrés pour les contrôles de lavage).
- Les billes sont ensuite remises en suspension dans du PBS pour donner 50% (p / v) lisier et stockées dans un réfrigérateur à 4 ° C jusqu'à utilisation. La concentration en protéine a été estimée par dosage de Bradford (selon les instructions du fabricant).
Partie 2: Préparation des lysats ensemble du cerveau
P2X2 récepteurs sont connus pour être abondamment exprimé dans le cerveau 8. Dans les présentes analyses, nous avons cherché à identifier les protéines interagissant avec les récepteurs P2X2 à partir de lysats de cerveau de rat entier (Fig. 3).
- Cerveau de rat adulte a été récolté (animaux ont été sacrifiés selon une UCLA IAACUC approuvé le protocole et selon les NIH Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire) et rincés immédiatement PBS glacé (3X).
- Pour lyser les cellules de 10 ml (~ 5 fois le poids humide du cerveau récoltés) de tampon de lyse glacée contenant 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, EDTA 10 mM, EGTA 1 mM, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, PMSF 1 mM, 5 ug / ml de leupeptine, 1% (v / v) NP-40, et un comprimé de cocktail inhibiteur de protéase a été ajouté au cerveau récoltés.
- Tissu cérébral a été homogénéisé sur la glace avec un homogénéiseur Dounce en verre jusqu'à obtenir un mélange homogène de consistance a été atteint.
- Lysat cellulaire a été centrifugé à 2000 g pendant 5 minutes pour éliminer les cellules ininterrompue. Le surnageant a été recueilli et filé à nouveau à 29000 g pendant 60 minutes pour enlever les organites intacts et les agrégats de membrane.
- Immédiatement après la centrifugation, le surnageant a été transféré dans un tube propre. La concentration en protéines du lysat ensemble du cerveau a été mesurée par dosage de Bradford (généralement ~ 15 mg / ml).
- Le lysat a été aliquote et conservé à-70C.
Partie 3: Isolement des protéines P2X2 C-queue associés
Afin d'identifier les partenaires de liaison de P2X2 CT-TPS à partir de lysats ensemble du cerveau, un menu déroulant dosage a été effectué en utilisant CT-GST immobilisées sur billes de glutathion-sépharose 4B comme appât. Pour les contrôles, la GST seule liés à des billes a été utilisé.
- Cerveau lysat a été prédédouanés avec des perles de la TPS pour 1 h à 4C. Le culot a été jeté et le surnageant a été utilisé pour d'autres analyses.
- Des quantités égales de la TPS et P2X2 CT-TPS (10 ug) lié au glutathion sépharose 4 billes B ont été incubées pendant la nuit avec 100 g de protéines solubilisées prédédouanés partir d'un lysat cerveau de rat entier, avec une rotation à 4 ° C dans le tampon de lyse.
- Perles ont été centrifugés à 1000 g pendant 5 min et le surnageant a été jeté.
- Les billes ont été lavées une fois avec le tampon de lyse et bouilli dans modifiés Laemli buffer [4% (p / v) de SDS, 10% (v / v) 2-mercaptoéthanol, 2% (v / v) de glycérol, 0,004% (p / v) de bleu de bromophénol et 0,125 M pH 6,8 TrisCl] pendant 5 min.
- Les échantillons ont été centrifugés à 5000 g pendant 5 min et le surnageant séparés par 10% SDS-PAGE (figure 4). Les gels ont été colorés avec du gel SYPRO Ruby protéines tache (selon les instructions du fabricant) et visualisées sous lumière ultraviolette. P2X2 CT-protéines associées ont été comparés avec ceux récupérés en utilisant la TPS nul comme appât. Quatre répliques ont été réalisées biologiques (soit quatre cerveaux et quatre menus déroulants indépendants).
Partie 4: Identification des protéines.
Les protéines séparées par électrophorèse sur gel ont été excisée du gel et identifiés par spectrométrie de masse 12. Remarque: l'absence de poussière au long du processus est essentielle pour réduire la contamination de kératine. L'expérimentateur doit porter un masque, filet à cheveux et des gants en tout temps et ne jamais toucher la région de gel d'intérêt sans l'utilisation de gants.
- Toutes les bandes de protéines visibles récupéré de l'attraction P2X2 bas ont été excisées avec une lame de rasoir propre et coupée en dés (Fig. 4). Régions correspondantes du gel de la TPS-nulle déroulant voies ont également été excisées de la même manière sans égard aux taches bande (bandes spécifiques pour l'appât TPS-nulle ont également été excisée et identifiés) pour s'assurer que la présence de protéines en dessous du niveau de la sensibilité coloration n'a pas été manquée.
- Les morceaux de gel ont été incubées avec 200 pl de 50 mM de bicarbonate d'ammonium dans 50% (v / v) d'acétonitrile (ACN) et les tubes vortex pendant 15 min à température ambiante. Répétez cette étape de lavage.
- Les morceaux de gel ont été déshydratés par addition de 200 ul d'acétonitrile (morceaux de gel devrait diminuer et deviennent opaques en couleur).
- Acétonitrile a été enlevé et les morceaux de gel séché dans un speedvac pour ~ 10 min.
- Les morceaux de gel sont ensuite incubées avec 30 pl de l'fraîchement préparés Tris 10 mM DTT/10 mm (2-carboxy-éthyl) chlorhydrate de phosphine (PTCE) d'un volume suffisant pour immerger les pièces. Cela a été laissé pendant 30 min à bain d'eau 56C.
- Suivant la solution la TNT a été remplacé par 100 ul de bicarbonate d'ammonium 500 mM en solution d'acétonitrile 50% et les tranches de gel lavée avec du bicarbonate ammounium.
- La solution de lavage a été aspirée et 200 ul d'acétonitrile ajouté à déshydrater les gels.
- L'acétonitrile a ensuite été enlevé et 100 ul fraîchement préparés solution 100 mM iodoacétamide a été ajouté à alkylat sulfhydryls libre. Cette étape a procédé pendant 25 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Solution iodoacétamide a été enlevé et les morceaux de gel sont lavées avec 200 ul de 50 mM de bicarbonate d'ammonium dans acétonitrile à 50% (pH 8,0) pendant 2 min tout en vortex. Cette étape de lavage a été répété.
- Après avoir retiré la solution de lavage, les morceaux de gel ont été incubées avec 200 ul d'acétonitrile, qui est ensuite éliminé par speedvac pour ~ 10min.
- À cette étape, les morceaux de gel sont prêtes pour la digestion de trypsine. Morceaux de gel ont été incubés dans 30 ul solution de trypsine (20 ng / uL concentration de travail) et placé sur la glace pendant 10 min pour les gels d'être bien gonflés. Trypsine en excès est éliminé et réhydratés particules de gel recouvert de 30 ul avec 50 mM de bicarbonate d'ammonium pour les maintenir immergés tout au long de digestion qui a été autorisé à procéder pendant 12 à 16 heures à 37C.
- Cinq ul de 5% (v / v) d'acide formique est ajouté pour désactiver la digestion par la trypsine et d'arrestation.
- Les tubes ont été vortexés pour ~ 15 min et centrifugé brièvement pour amener le liquide au fond du tube qui a ensuite été transféré à un endroit propre et étiqueté flacon de 0,5 ml.
- Suivant 30 ul de 0,1% (v / v) d'acide formique dans l'acétonitrile à 50% a été ajouté à des morceaux de gel de sorte qu'ils étaient juste couverte suivie par deux vortex pendant 10-15 min, séparées par une brève centrifugation. Cette étape a été répétée une fois, en remplacement de l'acide formique-acétonitrile entre les étapes.
- Le liquide final a été enlevé et toutes les solution d'extraction combinés dans un seul flacon. Ce volume a été réduit à environ 30 uL dans le speedvac. L'échantillon était maintenant prêt pour la phase de nano-chromatographie liquide inverse et l'identification des protéines par spectrométrie de masse. Dans cet exemple précis, cette étape est réalisée sur un spectromètre Orbi-piège de masse en tandem à partir ThermoFIsher (choisi pour sa précision de la masse élevée, cycle rapide pour la détection de protéines et généralement robustes fonctionnalités d'exploitation), bien que d'autres modèles et d'instruments de fabricants pourraient facilement être couplé avec l'approche décrite à ce point.
- Les détails et les critères pour l'analyse par spectrométrie de masse sont maintenant brièvement présentées. Tous les peptides ont été séparés par phase inverse nano-LC (Eksigent) et des peptides ont été chargés sur une phase inverse C18 colonne à un débit de 3 l / min. Une phase mobile était de 0,1% d'acide formique et ACN 2% dans de l'eau; phase mobile B était de 0,1% d'acide formique et 20% d'eau dans l'ACN. Les peptides ont été élues de la colonne à un débit de 220 nl / min en utilisant un gradient linéaire de 5% de B à B 50% plus de 90 min, puis à B 95% en 5 min, et enfin maintenir constante B de 95% pendant 5 min . Les spectres ont été acquis en dépendant des données avec le mode d'Orbi-piège utilisé pour les analyses MS et LTQ pour MS / MS scans. Les peptides ont été identifiés par une recherche des spectres avec la base des rats IPI v.3.53 en utilisant l'algorithme SEQUEST intégrée dans le logiciel Bioworks. Chaque peptide a rencontré les critères suivants: XCorr ≥ 2 (1), ≥ 3 (2), ≥ 4 (3), et DeltaCN> 0,1. Tous les spectres utilisés pour l'identification des protéines étaient contrôlées manuellement et aucune protéines acceptées lorsque moins de deux peptides ont été identifiés. Seuls les protéines présentes après chacune des quatre menus déroulants et P2X2 absent pendant menus déroulants TPS-nulle ont été considérés pour d'autres analyses.
Figure 1. Représentation schématique d'une sous-unité du récepteur P2X2. A. La caricature illustre la topologie d'un sous-unité du récepteur P2X2. Le domaine cytosolique constitué de N et C terminales. Le C-terminale de récepteurs P2X2 (rouge) a été utilisé comme appât pour tirer vers le bas dosage. Séquence d'acides aminés B. du récepteur P2X2 C-terminale utilisée dans cette étude.
Figure 2. Diagramme et la ligne de temps du protocole utilisé pour l'expression, la purification, déroulez et l'identification des protéines. Nous montrons le contour du protocole avec la ligne du temps. Lysat cerveau adulte de rat a été fraîchement préparés immédiatement avant l'utilisation pour la tirer vers le bas dosages.
Figure 3. Représentation schématique de l'analyse protéomique des binaires P2X2 C-terminale du réseau dans le cerveau du rat. Le C-terminale de récepteurs P2X2 fusionné avec la protéine liée à la TPS perles TPS a été utilisée pour tirer vers le bas dosages. Cerveau lysat a été préparé et les protéines ont été incubées avec les protéines recombinantes immobilisées. Fraction libre est lavée avec le tampon de lyse. Les protéines ont été identifiées par spectrométrie de masse.
Figure 4. Identification des partenaires de liaison de l'extrémité C-terminale P2X2 récepteurs. Sypro gel coloré montrant un spectre de protéines putatives qui interagissent avec le C-terminale des récepteurs fusionné avec TPS (boîte bleue). Contrôles voies pour la TPS seulement (boîte jaune) et le glutathion billes de sépharose seuls sont également représentées. Les flèches indiquent des exemples de bandes uniques qui ont été excisées pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse.
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Discussion
Les canaux ioniques sont une classe importante de protéines membranaires intégrales. Ils contiennent des pores remplis d'eau que de manière sélective permettre la circulation des ions bas leurs gradients électrochimiques travers la membrane plasmique. Canaux ioniques porte entre ouverte et les états fermé. L'étape de déclenchement est déclenché par les émetteurs (par exemple l'ATP) en cas de canaux ioniques ligand P2X gated, ou il peut être régulé par des interactions avec d'autres protéines. La dernière décennie a vu une augmentation dans notre compréhension de comment les récepteurs P2X lient l'ATP 13, mais le rôle des protéines dans la régulation de la fonction auxiliaires P2X reste moins bien compris. L'approche décrite dans ce protocole est conçu pour identifier les complexes de signalisation des récepteurs P2X2 formé par en examinant (dans un premier temps) les protéines interagissant avec le C-terminale intracellulaire. Une carte complète du complexe de signalisation du récepteur P2X2 donnera un aperçu beaucoup plus nécessaire dans la physiopathologie de ces canaux fascinants.
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Acknowledgments
SW et TMV sont soutenus par le NHLBI et NCRR au National Institutes of Health. BSK et HS sont soutenus par le NINDS et NIGMS des Instituts nationaux de la Santé.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR international | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD Millipore | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR international | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros Organics | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 |
References
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