Summary
Descriviamo un semplice protocollo per identificare le proteine del cervello che si legano al capolinea pieno C lunghezza di ATP-dipendenti P2X2 recettori. L'estensione e l'applicazione sistematica di questo approccio a tutti i recettori P2X dovrebbe portare ad una migliore comprensione di segnalazione dei recettori P2X.
Abstract
Ligando-canali ionici alla base della comunicazione sinaptica nel sistema nervoso 1. Nei mammiferi ci sono tre famiglie di canali ligando-dipendenti: il ciclo Cys, il glutammato-dipendenti ed i canali recettori P2X 2. In ogni caso vincolante del trasmettitore porta alla apertura di un poro attraverso il quale gli ioni scendono i loro gradienti elettrochimici. Molti canali ligando-dipendenti sono permeabili agli ioni calcio 3, 4, che hanno ruoli di segnalazione a valle 5 (regolazione dei geni ad esempio) che possono superare la durata di apertura del canale. Così ligando-dipendenti canali in grado di segnalare su scale temporali di ampia portata da pochi millisecondi a giorni. Alla luce di questi importanti ruoli, è necessario capire come ligando-canali ionici si sono regolati da proteine, e come queste proteine possono regolare segnalazione. Studi recenti suggeriscono che molti, se non tutti, i canali possono far parte di complessi proteina di segnalazione 6. In questo articolo spiegheremo come identificare le proteine che si legano al C-terminale aspetti del settore P2X2 recettore citosolico.
Recettori P2X sono ATP-dipendenti canali di comunicazione e composto da sette subunità (P2X1-P2X7). Recettori P2X sono ampiamente espresse nel cervello, dove mediano la trasmissione sinaptica eccitatoria e facilitazione presinaptica di neurotrasmettitori versione 7. Recettori P2X si trovano nelle cellule eccitabili e non eccitabili e mediare ruoli chiave nella segnalazione neuronale, l'infiammazione e la funzione cardiovascolare 8. P2X2 recettori sono abbondanti nel sistema nervoso 9 e sono al centro di questo studio. Ogni subunità P2X è pensato di possedere due segmenti di membrana spanning (TM1 e TM2) separate da una regione extracellulare 7 e intracellulare N e C Termini (Fig. 1a) 7. Subunità P2X 10 (P2X1-P2X7) mostrano omologia di sequenza del 30-50% a livello di aminoacidi 11. Recettori P2X contengono solo tre subunità, che è il più semplice stechiometria tra recettori ionotropici. Il P2X2 C-terminale è composta da 120 aminoacidi (Fig. 1b) e contiene numerose proteine siti consenso docking, supportando l'ipotesi che P2X2 recettore può essere parte di complessi di segnalazione. Tuttavia, anche se diverse funzioni sono state attribuite al C-terminale del recettore P2X2 9 nessuno studio ha descritto i partner molecolari che paio al lato di questa proteina intracellulare attraverso tutta la lunghezza C-terminale. In questo documento si descrivono i metodi di un approccio di proteomica per identificare le proteine che interagiscono con l'intera lunghezza C-terminale del recettore P2X2.
Protocol
Procedure sperimentali
La procedura sperimentale (Fig. 2) si compone di quattro parti che sono descritti in un modo graduale di seguito.
Parte 1: subcloning ed espressione del C-terminale del recettore P2X2.
Abbiamo espresso tutta la lunghezza C-terminale del recettore P2X2 nei batteri per identificare le proteine del cervello a cui si lega.
- Il C-terminale (residui 353-472) del recettore P2X2 (Fig. 1) è stato amplificato mediante PCR, clonati in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) e verificato con il sequenziamento.
- Il plasmide ricombinante è stato trasformato in E. Coli (BL21) per l'espressione di proteine ricombinanti.
- Glicerolo scorte di batteri (E. coli BL21) contenente i P2X2 CT-GST plasmide sono stati raschiati con un puntale sterile e inoculata in 5 ml di Luria-Bertani (LB) con idonei mezzi di comunicazione marcatore selettivo (50 g / ml di ampicillina) e incubato per una notte in un agitatore orbitale a 37 ° C.
- Le culture cresciute overnight sono stati inoculati in 250 ml di media LB con un antibiotico adatto (50 mg / ml di ampicillina) e incubato in un agitatore orbitale a 250 rpm per 2-3 ore a 37 ° C fino a quando la densità ottica a 600 nm raggiunto ~ 0,6-0,7.
- La cultura è stata indotta con 1 mM di IPTG e ulteriormente incubate a 37 ° C per 3 ore per l'espressione della proteina.
- La cultura è stato poi girato a 5000 g per 15 min a 4 ° C (1 ml di coltura è stato salvato per analizzare il livello di espressione ed etichettato come 'indotto'). Supernatante è stato scartato e il pellet è stato risospeso in 20 ml di Saline Tris-EDTA (STE) buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0).
- La sospensione è stata filata a 5000 g per 15 minuti in un tubo da 50 ml falco. Il supernatante è stato scartato e la semi-secco pellet è stato congelato a-70C durante la notte.
- I-70C pellet è stato risospeso in 40 ml di tampone di lisi freddo ghiaccio (2% (w / v) sarkosyl, 15 mg di lisozima, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH7.5, 5 mM DTT e completa compressa inibitore della proteasi) , e la sospensione è stata incubata in ghiaccio per 30 min. Durante questa incubazione, 3 ml Glutatione-Sepharose perline 4B sono stati lavati con 20 ml di tampone salino fosfato (PBS) e 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) tritonX-100 in PBS), seguita da PBS. Le perle sono stati risospesi in 1 ml di PBS.
- La sospensione batterica è stata freeze-scongelati 3 volte in azoto liquido e sonicato (1s on / off, 30 micron per 3 minuti in ghiaccio) e ulteriormente incubate per 30 minuti con il 4% (v / v) Triton X-100, 10 mM MgSO 4 e 2 mM ATP sul ghiaccio.
- Il lisato è stato girato a 20000 g per 15 minuti a 4C e pellet è stato scartato (un campione di pellet e 1 ml di surnatante è stato salvato per la pagina di SDS per testare la quantità di proteine nel citoplasma e membrane). Il supernatante è stato incubato con le perline per 1 ora (o tutta la notte) a 4C.
- Le perle erano filata a 500 g per 5 minuti e il supernatante è stato scartato (campione è stato salvato per la frazione non legata). Le perle sono stati lavati con T-PBS cinque volte (lavaggi sono stati salvati per i controlli di lavaggio).
- Le perle sono stati poi risospesi in PBS per dare il 50% (w / v) liquami e conservati in frigorifero a 4C fino al momento dell'uso. La concentrazione delle proteine è stato stimato da Bradford test (per le istruzioni del produttore).
Parte 2: Preparazione dei lisati intero cervello
P2X2 recettori sono noti per essere abbondantemente espresso nel cervello 8. Nella presente analisi, abbiamo cercato di identificare le proteine che interagiscono con i recettori P2X2 da lisati cervello di ratto suo complesso (Fig. 3).
- Cervello di ratto adulto è stato raccolto (animali sono stati sacrificati in base ad un protocollo approvato IAACUC-UCLA e secondo la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio) e risciacquati immediatamente ghiaccio PBS freddo (3X).
- Per lisare le cellule da 10 ml (~ 5 volte il peso fresco del cervello raccolte) di tampone di lisi freddo ghiaccio contenente 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 5 mg / ml di leupeptina, 1% (v / v) NP-40, e un inibitore della proteasi tavoletta cocktail è stato aggiunto al cervello raccolto.
- Tessuto cerebrale è stato omogeneizzato su ghiaccio con un omogeneizzatore Dounce vetro fino a una miscela di consistenza omogenea è stato raggiunto.
- Lisato cellulare è stato girato a 2000 g per 5 minuti per rimuovere le cellule ininterrotta. Il surnatante è stato raccolto e girato nuovamente a 29000 g per 60 minuti per rimuovere organuli intatti e aggregati membrana.
- Immediatamente dopo la centrifugazione il surnatante è stato trasferito in una provetta pulita. La concentrazione proteica del lisato intero cervello è stata misurata mediante saggio Bradford (di solito ~ 15 mg / ml).
- Il lisato è stato aliquotati e conservato a-70C.
Parte 3: Isolamento di P2X2 C-coda proteine associate
Per identificare i partner legame di P2X2 CT-GST da lisati intero cervello, un pull down test è stato eseguito utilizzando CT-GST immobilizzato su glutatione sefarosio perline 4B come esca. Per i controlli, GST solo legati a microsfere è stato utilizzato.
- Cervello lisato è stato precleared con perline GST per 1 ora a 4C. Il pellet è stato scartato ed il surnatante è stato utilizzato per ulteriori analisi.
- La stessa quantità di GST e P2X2 CT-GST (10 mcg) legato a glutatione sefarosio 4 perle B sono state incubate overnight con 100 g di proteine precleared solubilizzato da lisato cervello di ratto intero, con rotazione a 4C nel buffer di lisi.
- Perline erano filata a 1000 g per 5 minuti e il supernatante è stato scartato.
- Le perle sono stati lavati una volta con il tampone di lisi e bollito in modificata Laemli tampone [4% (w / v) di SDS, 10% (v / v) 2-mercaptoetanolo, 2% (v / v) glicerolo, 0,004% (w / v) bromofenolo blu e 0,125 M TrisCl pH 6,8] per 5 min.
- I campioni sono stati filata a 5000 g per 5 minuti e il surnatante separato del 10% SDS-PAGE (Fig. 4). Gel sono stati colorati con gel SYPRO proteine Rubino macchia (secondo le istruzioni del produttore) e visualizzati sotto luce ultravioletta. P2X2 CT-proteine associate sono stati confrontati con quelli recuperati utilizzando GST-nullo come esca. Quattro repliche biologiche sono state eseguite (cioè quattro cervelli e quattro bassi tirare indipendenti).
Parte 4: Identificazione delle proteine.
Le proteine separate mediante elettroforesi su gel sono state escisse dal gel e identificati mediante spettrometria di massa 12. Nota: l'assenza di polvere durante il processo è fondamentale per ridurre la contaminazione cheratina. Lo sperimentatore deve indossare una maschera, retina per capelli e guanti in ogni momento e non toccare mai la regione di interesse gel senza l'uso di guanti.
- Tutte le bande di proteine visibile recuperato dal menu a discesa P2X2 sono stati asportati con una lametta pulita e tagliata a dadini (Fig. 4). Regioni corrispondenti del gel nel GST-pull down nullo corsia sono stati asportati nello stesso modo senza riguardo alle macchie banda (bande specifiche per la GST-esca nulli sono stati asportati e individuati) per assicurare che la presenza di proteine di sotto del livello di sensibilità colorazione non è stato mancato.
- I pezzi di gel sono stati incubati con 200 ml di 50 mM di bicarbonato di ammonio nel 50% (v / v) acetonitrile (ACN) e dei tubi in agitazione per 15 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questa fase di lavaggio.
- I pezzi di gel sono stati disidratati con l'aggiunta di 200 microlitri acetonitrile (pezzi gel dovrebbe restringersi e diventare opaco a colori).
- Acetontrile è stato rimosso ei pezzi gel essiccato in un speedvac per ~ 10 min.
- I pezzi di gel sono state poi incubate con 30 microlitri della preparati al momento 10 mM DTT/10 mM Tris (2-carbossi-etil) cloridrato fosfina (TCEP) del volume sufficiente per immergere i pezzi. Questo è stato lasciato per 30 minuti a bagnomaria 56C.
- Avanti la soluzione digitale terrestre è stato sostituito con 100 l 500 mM di bicarbonato di ammonio in soluzione acetonitrile 50% e le fette di gel lavata con il bicarbonato ammounium.
- La soluzione di lavaggio è stata aspirata e 200 ml di acetonitrile aggiunto a disidratare il gel.
- Acetonitrile è stato poi rimosso e 100 ul preparati al momento 100 soluzione Iodoacetamide mM è stato aggiunto al alchilato sulfhydryls libero. Questo passo ha proceduto per 25 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Soluzione Iodoacetamide è stato rimosso ed i pezzi di gel sono stati lavati con 200 ml di bicarbonato di ammonio 50 mM nel 50% acetontrile (pH 8,0) per 2 minuti, mentre vortex. Questa fase di lavaggio è stata ripetuta.
- Dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio, i pezzi di gel sono stati incubati con 200 microlitri acetonitrile che è stato poi rimosso da speedvac per ~ 10 minuti.
- A questo punto i pezzi di gel sono pronti per la digestione tripsina. Pezzi di gel sono stati incubati in 30 microlitri soluzione di tripsina (20 ng / mL concentrazione di lavoro) e messo in ghiaccio per 10 min per i gel di essere ben gonfio. Tripsina in eccesso è stato rimosso e reidratato particelle di gel sovrapposto con 30 microlitri con 50 mM di bicarbonato di ammonio per tenerli immersi per tutta la digestione, che è stato permesso di proseguire per 12 a 16 ore a 37 ° C.
- Cinque microlitri del 5% (v / v) di acido formico viene aggiunto per disattivare la digestione tripsina e l'arresto.
- Tubi erano in agitazione per circa 15 minuti e centrifugati brevemente per portare il liquido sul fondo della provetta che è stato poi trasferito in un pulito ed etichettato 0,5 ml Fiala.
- Prossimi 30 ml di 0,1% (v / v) in acido formico 50% acetonitrile è stato aggiunto a pezzi gel quindi erano appena coperto seguito da vortex due volte per 10-15 minuti, separati per centrifugazione breve. Questo passo è stato ripetuto una volta, in sostituzione del acido formico-acetonitrile tra i passaggi.
- Il liquido finale è stato rimosso e tutte le soluzione di estrazione combinati in un singolo flaconcino. Questo volume è stato ridotto a circa il 30 uL nel speedvac. Il campione è ora pronto per l'inversione di fase nano-cromatografia liquida e l'identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa. In questo esempio specifico, questo passo è effettuata su Orbi-trappola spettrometro di massa tandem da ThermoFisher (scelta per la sua accuratezza di massa elevata, ciclo rapido per il rilevamento delle proteine e le caratteristiche di funzionamento in generale robusta), anche se altri modelli e strumenti produttori 'potrebbe essere facilmente accoppiato con l'approccio descritto a questo punto.
- I dettagli e criteri per l'analisi di spettrometria di massa sono ora brevemente presentati. Tutti i peptidi sono stati separati da fase inversa nano-LC (Eksigent) e peptidi sono stati caricati su una C18 fase inversa colonna ad un flusso di 3 ml / min. Una fase mobile è stata dello 0,1% di acido formico e 2% ACN in acqua; B fase mobile è stata dello 0,1% di acido formico e il 20% d'acqua in ACN. Peptidi sono stati eluiti dalla colonna ad una portata di 220 nl / min con un gradiente lineare B dal 5% al 50% B più di 90 minuti, poi al 95% di B in 5 minuti e, infine, mantenendo costante B del 95% per 5 min . Spettri sono stati acquisiti in data-dependent modalità con le Orbi-trappola usati per le scansioni MS e LTQ per MS / MS scansioni. Peptidi sono stati identificati dalla ricerca gli spettri sul database ratto IPI v.3.53 con l'algoritmo SEQUEST integrato nel pacchetto software Bioworks. Ogni peptide soddisfatto i seguenti criteri: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (+3), e DeltaCN> 0,1. Tutti gli spettri utilizzati per l'identificazione delle proteine sono stati ispezionati manualmente e non proteine accettato quando a meno di due peptidi sono stati identificati. Proteine presenti solo dopo ciascuna delle quattro P2X2 bassi tirare e assente durante GST-nullo tirare bassi sono stati considerati per ulteriori analisi.
Figura 1. Rappresentazione schematica di una subunità del recettore P2X2. R. Il cartone animato illustra la topologia di una subunità del recettore P2X2. Il dominio citosolico è composto da N e C termini. Il C-terminale del recettore P2X2 (rosso) è stato utilizzato come esca per tirare giù saggio. Sequenza di acido B. aminoacidi del recettore P2X2 C-terminale utilizzato in questo studio.
Figura 2. Diagramma di flusso e la linea del tempo del protocollo usato per l'espressione, la purificazione, tirare verso il basso e l'identificazione delle proteine. Mostriamo il contorno del protocollo con la linea del tempo. Lisato cervello di ratto adulto è stato preparato fresco immediatamente prima dell'uso per il pull down test.
Figura 3. Rappresentazione schematica delle analisi proteomica binario di P2X2 C-terminale della rete nel cervello di ratto. Il C-terminale del recettore P2X2 fuse con le proteine GST legati a microsfere GST è stato utilizzato per abbattere i test. Cervello lisato è stato preparato e proteine sono state incubate con le proteine ricombinanti immobilizzato. Frazione libera è stato lavato con il tampone di lisi. Le proteine sono stati identificati mediante spettrometria di massa.
Figura 4. Identificazione di partners vincolante del C-terminale del recettore P2X2. Sypro gel colorato che mostra uno spettro di proteine putative che interagiscono con il C-terminale dei recettori fuse con GST (blue box). Corsie controlli per GST solo (scatola gialla) e glutatione perline sefarosio solo sono mostrati. Le frecce indicano esempi di gruppi unici che sono stati asportati per ulteriori analisi mediante spettrometria di massa.
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Discussion
Canali ionici sono una classe importante di proteine integrali di membrana. Essi contengono pori riempiti d'acqua che selettivamente permettono il movimento degli ioni i loro gradienti elettrochimici attraverso la membrana plasmatica. Ion cancello canali tra gli stati aperti e chiusi. Il passo gating è innescato da trasmettitori (es. ATP) in caso di P2X canali ionici ligando gated, o può essere regolata da interazioni con altre proteine. L'ultimo decennio ha visto un aumento della nostra comprensione di come i recettori P2X legano ATP 13, ma il ruolo delle proteine accessorie nella regolazione della funzione P2X ancora poco chiare. L'approccio descritto in questo protocollo è progettato per identificare i complessi di segnalazione formato da P2X2 recettori esaminando (come primo passo) le proteine che interagiscono con il intracellulare C-terminale. Una mappa completa del complesso recettore P2X2 segnalazione fornirà visione tanto necessaria nella patofisiologia di questi canali affascinante.
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Acknowledgments
SW e TMV sono supportati dal NCRR e NHLBI presso il National Institutes of Health. BSK e HS sono supportati dal NINDS e NIGMS del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR international | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD Millipore | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR international | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros Organics | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 |
References
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