Summary
Vi beskriver ett enkelt protokoll för att identifiera hjärnan proteiner som binder till hela längden C ändstationen av ATP-gated P2X2 receptorer. Utbyggnaden och systematisk tillämpning av denna metod till alla P2X receptorer förväntas leda till en bättre förståelse för P2X receptor signalering.
Abstract
Ligandreglerade jonkanaler ligger bakom synaptisk kommunikation i nervsystemet 1. Hos däggdjur finns det tre familjer av ligandreglerade kanaler: CYS slinga, glutamatreglerade och P2X kanalerna receptor 2. I varje fall bindning av sändare leder till öppnandet av en por genom vilken joner rinna ner sina elektrokemiska gradienter. Många ligandreglerade kanaler också släpper igenom kalciumjoner 3, 4, som nedströms har signalering roller fem (t.ex. genreglering) att ha längre varaktighet av kanal öppning. Således ligandreglerade kanaler kan signalera över breda tidsskalor från några få millisekunder till dagar. Med tanke på dessa viktiga roller är det nödvändigt att förstå hur ligandreglerade jonkanaler sig regleras av proteiner, och hur dessa proteiner kan ställa signalering. Färska studier tyder på att många, om inte alla, kan kanalerna vara en del av protein signalering komplex sex. I den här artikeln förklarar vi hur man kan identifiera de proteiner som binder till C-terminalen aspekter av P2X2 receptorn cytosoliska domän.
P2X receptorer är ATP-gated munikationsvägar och består av sju subenheter (P2X1-P2X7). P2X receptorer är allmänt uttryckta i hjärnan, där de förmedlar excitatoriska synaptisk transmission och presynaptiska underlättande av signalsubstansen släpper 7. P2X receptorer finns i hetsiga och icke-retbara celler och medla nyckelroller i neuronal signalering, inflammation och kardiovaskulär funktion 8. P2X2 receptorer är rikligt i nervsystemet 9 och är i fokus för denna studie. Varje P2X subenhet är tänkt att ha två membran som spänner segment (TM1 & TM2) separerade av ett extracellulärt region 7 och intracellulära N och C ändstationer (Fig 1a) 7. P2X subenheter 10 (P2X1-P2X7) visar 30-50% sekvenshomologi på aminosyra nivå 11. P2X receptorer innehåller bara tre subenheter, som är den enklaste stökiometri bland ionotropic receptorer. Den P2X2 C-terminal består av 120 aminosyror (Fig 1b) och innehåller flera protein webbplatser dockning konsensus, stöder hypotesen att P2X2 receptor kan vara en del av signalering komplex. Trots att flera funktioner har tillskrivits C-ändstationen av P2X2 receptorer 9 ingen studie har beskrivit de molekylära partners som par till den intracellulära sidan av detta protein via fulla längd C-terminal. I den här metoder dokument beskriver vi ett proteomik metod för att identifiera de proteiner som interagerar med full längd C-ändstationen av P2X2 receptorer.
Protocol
Experimentella
Den experimentella förfarandet (Fig. 2) består av fyra delar som beskrivs i en stegvis sätt nedan.
Del 1: Subcloning och uttryck i C-ändstationen av P2X2 receptorer.
Vi har uttryckt fulla längd C-terminala P2X2 receptorer i bakterier för att identifiera hjärnan proteiner som den binder.
- C-terminus (rester från 353 till 472) av P2X2 receptorn (Figur 1) var förökas med PCR, klonade i pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) och verifieras med sekvensering.
- Det rekombinant plasmid förvandlades till E. Coli (BL21) för uttryck av rekombinanta proteiner.
- Glycerol lager av bakterier (E. coli BL21) som innehåller P2X2 CT-GST plasmid har skrapat med en steril pipett spets och inokuleras i 5 ml Luria-Bertani (LB) media med lämpliga selektiv markör (50 g / ml ampicillin) och inkuberas över natten i en roterande skak vid 37C.
- De kulturer vuxit över natten var inokuleras i 250 ml LB media med ett lämpligt antibiotikum (50 mikrogram / ml ampicillin) och inkuberas i en roterande skak vid 250 rpm under 2-3 timmar vid 37C tills den optiska densiteten vid 600 nm nått ~ 0,6-0,7.
- Kulturen var inducerade med 1 mm IPTG och ytterligare inkuberas vid 37C i 3 timmar för protein uttryck.
- Kulturen var då spunnet vid 5000 g under 15 minuter vid 4C (1 ml av kulturen sparades för att analysera uttrycket nivå och märkas "framkallade"). Supernatanten var kasseras och pellets var suspenderade i 20 ml saltlösning Tris-EDTA (STE) buffert (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0).
- Suspensionen delades vid 5000 g under 15 min i en 50 ml Falcon rör. Supernatanten var kasseras och halvtorr pellets var frusen på-70C över natten.
- The-70C pellets var suspenderade i 40 ml iskall lyseringsbuffert (2% (w / v) sarkosyl, 15 mg lysozym, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH7.5, 5 mm DTT och komplett proteashämmare tablett) och fjädring var inkuberades på is i 30 min. Under denna inkubation var 3 ml glutation-Sepharose 4B pärlor tvättas med 20 ml fosfatbuffert saltlösning (PBS) och 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) tritonX-100 i PBS) följt av PBS. Kulorna var suspenderade i 1 ml PBS.
- Bakteriesuspensionen var frys-tinat 3 gånger i flytande kväve och sonicated (1s på / av, 30 mikron i 3 min på is) och ytterligare inkuberas i 30 minuter med 4% (v / v) Triton X-100, 10 mm MgSO 4 och 2 mm ATP på is.
- Den lysat delades vid 20000 g under 15 min vid 4C och pellets var kasseras (ett prov från pellets och 1 ml av supernatanten sparades för SDS sida att testa mängder av proteiner i cytosolen och membran). Supernatanten var inkuberas med pärlor för en timme (eller över natten) i 4C.
- Kulorna var snurrade på 500 g för 5 min och supernatanten var kasseras (prov sparades för obundna fraktionen). Kulorna spolades med T-PBS fem gånger (tvättar räddades för tvätt kontroller).
- Kulorna var då suspenderade i PBS för att ge 50% (w / v) Flytgödsel och förvaras i kylskåp vid 4C till användning. Proteinkoncentrationen uppskattades av Bradford analys (enligt tillverkarens anvisningar).
Del 2: Förberedelse av hela hjärnan lysates
P2X2 receptorer är kända för att vara rikligt uttryckas i hjärnan 8. I det aktuella analyser, försökte vi identifiera de proteiner som interagerar med P2X2 receptorer från råtta hela hjärnan lysates (Fig. 3).
- Adult råtta hjärna har skördats (djur offrades enligt en UCLA IAACUC-godkända protokoll och enligt NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur) och sköljas omedelbart iskallt PBS (3X).
- För att Lyse cellerna 10 ml (~ 5 gånger våtvikt skördade hjärnan) av iskall lyseringsbuffert innehåller 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mm EGTA, 1 mM NaF, 1 mm Na 3 VO 4, 1 mm PMSF, 5 mikrogram / ml leupeptin var 1% (v / v) NP-40, och en proteashämmare cocktail tabletten läggs till den skördade hjärnan.
- Hjärnvävnad var homogeniserade på is med ett glas Dounce homogeniseringsapparat tills en blandning av homogen konsistens uppnåddes.
- Cell lysat delades vid 2000 gi 5 minuter för att avlägsna den obrutna celler. Supernatanten samlades in och snurrade igen vid 29 tusen g under 60 minuter för att avlägsna intakt organeller och aggregat membran.
- Omedelbart efter centrifugeringen supernatanten överfördes till ett rent rör. Proteinhalten i hela hjärnan lysat mättes genom Bradford analys (vanligtvis ~ 15 mg / ml).
- Den lysat var alikvoteras och förvaras vid-70C.
Del 3: Isolering av P2X2 C-tail associerade proteiner
Att identifiera bindande partners P2X2 CT-GST från hela hjärnan lysates, en dra ner test utfördes med hjälp av CT-GST immobiliserade på glutation sepharose 4B pärlor som bete. För kontroller var GST ensam bunden till pärlorna som används.
- Brain lysat var precleared med GST pärlor för 1 timme på 4C. Pelleten var kasseras och supernatanten användes för vidare analyser.
- Lika delar moms och P2X2 CT-GST (10 mikrogram) bundna till glutation sepharose 4 B pärlor inkuberades över natten med 100 g precleared solubilised proteiner från råtta hela hjärnan lysat, med rotation på 4C i lyseringsbuffert.
- Pärlor delades vid 1000 gi 5 min och supernatanten var kasseras.
- Kulorna spolades en gång med lyseringsbuffert och kokt i modifierad Laemli buffert [4% (w / v) SDS, 10% (v / v) 2-merkaptoetanol, 2% (v / v) glycerol, 0,004% (w / v) Bromfenolblått och 0,125 M TrisCl pH 6,8] i 5 min.
- Proverna delades vid 5000 gi 5 min och supernatanten separerade med 10% SDS-PAGE (Fig 4). Geler färgades med SYPRO Ruby protein gel fläcken (enligt tillverkarens anvisningar) och visualiseras under ultraviolett ljus. P2X2 CT-associerade proteiner jämfördes med återhämtat dem som använder GST-null som bete. Fyra biologiska replikat utfördes (dvs fyra hjärnor och fyra oberoende nedgångar pull).
Del 4: Identifiering av proteiner.
Proteiner separeras med gelelektrofores klippts från gelen och identifieras med masspektrometri 12. OBS: avsaknad av damm under hela processen är avgörande för att minska keratin föroreningar. Försöksledaren ska bära ansiktsmask, hårnät och handskar hela tiden och aldrig röra gelen regionen av intresse utan användning av handskar.
- Alla synliga protein band återhämtat sig från den P2X2 dra ner klippts med ett rent rakblad och tärnad (Fig 4). Motsvarande områden i gelen i GST-null dra ner körfält var också skärs på samma sätt utan hänsyn till bandet färgning (band specifika för GST-null bete var också censurerade och identifieras) för att försäkra att närvaron av proteiner under nivån för färgning känslighet var inte missas.
- Gelen bitar inkuberades med 200 l 50 mm ammoniumbikarbonat i 50% (v / v) acetonitril (ACN) och rören vortexed i 15 min vid RT. Upprepa tvättningen.
- Gelen bitar var uttorkad genom att tillsätta 200 l acetonitril (gel bitar ska krympa och bli ogenomskinlig i färg).
- Acetontrile togs bort och gelen bitarna torkas i en speedvac för ~ 10 min.
- Gelen bitar var inkuberas sedan med 30 ìl av nyberedda 10 mM DTT/10 mM Tris (2-karboxi-etyl) fosfin hydroklorid (TCEP) av tillräcklig volym för att doppa bitarna. Detta var kvar i 30 min vid 56C vattenbad.
- Nästa DTT lösning ersattes med 100 l 500 mm ammoniumbikarbonat i 50% acetonitril lösning och skivor gelen tvättas med ammounium bikarbonat.
- Tvättlösningen blev aspirerade och 200 l acetonitril läggas att torka gelen.
- Acetonitril var då bort och 100 l nytillagade 100 mM iodoacetamide lösning lades till alkylatbensin gratis sulfhydryls. Detta steg fortsatte i 25 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Iodoacetamide lösning togs bort och gelen bitar spolades med 200 l 50 mm ammoniumbikarbonat i 50% acetontrile (pH 8,0) i 2 min medan vortexa. Detta tvättsteg upprepades.
- Efter att tvättlösningen var gelen bitar inkuberas med 200 l acetonitril som sedan togs bort genom speedvac för ~ 10min.
- I detta steg gelen bitar är klara för trypsin matsmältningen. Gel bitar inkuberades i 30 l trypsin lösning (20 ng / mikroliter arbetar koncentration) och placeras på is i 10 min för geler är väl svullen. Överskott trypsin togs bort och rehydreras gel partiklar överdragen med 30 l med 50 mm ammoniumbikarbonat att hålla dem nedsänkt under matsmältningen som tilläts fortsätta i 12 till 16 timmar vid 37C.
- Fem l på 5% (v / v) Myrsyra tillsätts för att stänga av trypsin och arrestera matsmältning.
- Rör var vortexed för ~ 15 min och centrifugeras kort låt vätskan i botten av röret som sedan övergick till en ren och märkt 0,5 ml injektionsflaska.
- Nästa 30 l på 0,1% (v / v) myrsyra i 50% acetonitril inkom i gel bitar så de var bara omfattas följdes av vortexa två gånger i 10-15 min, separerade med kort centrifugering. Detta steg var upprepas en gång, som ersätter myrsyra-acetonitril mellan stegen.
- Den slutliga flytande togs bort och alla extraktionslösning kombineras i en injektionsflaska. Denna volym minskade till ~ 30 UL i speedvac. Provet var nu redo för omvänd fas nano-vätskekromatografi och protein identifiering av masspektrometri. I detta exempel, är detta steg utförs på en Orbi-fällan tandem masspektrometer från ThermoFisher (valda för sin höga massa noggrannhet, snabb duty cycle för protein detektion och allmänt robust drift funktioner), men även andra modeller och tillverkare instrument lätt kan kombineras med det tillvägagångssätt som beskrivs i denna punkt.
- Detaljerna och kriterier för masspektrometrisk analyser är nu kortfattat presenteras. Alla peptider skildes genom omvänd fas nano-LC (Eksigent) och peptider lastades på en C18 omvänd-fas kolonn med en flödeshastighet på 3 l / min. Mobil fas A var 0,1% myrsyra och 2% ACN i vatten, mobila fasen B var 0,1% myrsyra och 20% vatten i ACN. Peptider var elueras från kolonnen med en flödeshastighet på 220 nl / min med hjälp av en linjär gradient från 5% B till 50% B över 90 minuter, sedan till 95% B under 5 min, och slutligen håller konstant 95% B för 5 min . Spectra förvärvades i data-beroende läget med Orbi-fällan används för MS skannar och LTQ för MS / MS genomsökningar. Peptider har identifierats genom att söka spektra mot råttan IPI databas v.3.53 med SEQUEST algoritm integrerats i Bioworks programpaketet. Varje peptid uppfyllde följande kriterier: XCorr ≥ 2 (1), ≥ 3 (2), ≥ 4 (3), och DeltaCN> 0,1. Alla spektra som används för proteinidentifiering var inspekteras manuellt och inga proteiner accepteras när mindre än två peptider har identifierats. Endast proteiner efter varje av de fyra P2X2 dra nedgångar och frånvarande under GST-null pull downs ansågs för vidare analyser.
Figur 1. Schematisk bild över en P2X2 receptor subenhet. A. Serien visar topologin av ett P2X2 receptor subenhet. Den cytosoliskt domän består av N och C Termini. C-ändstationen av P2X2 receptor (röd) användes som bete för att dra ner analysen.. B. aminosyrasekvens av P2X2 receptorn C-terminal som används i denna studie
Figur 2. Flödesschema och tid raden av protokoll som används för uttryck, rening, dra ner och identifiering av proteiner. Vi visar konturerna av protokollet med tidslinjen. Vuxen råtthjärna lysat var beredda färska omedelbart före användning för dra ner analyser.
Figur 3. Schematisk representation av den binära proteomik analys av P2X2 C-terminus nätverk hos råtta hjärnan. C-ändstationen av P2X2 receptorer smält med GST bundet till GST pärlor användes för pull down analyser. Brain lysat var beredd och proteiner inkuberades med immobiliserade rekombinanta proteiner. Obundna fraktionen spolades med lyseringsbuffert. Proteiner identifierades av masspektrometri.
Figur 4. Identifikation av bindande partner i C-ändstationen av P2X2 receptorer. Sypro färgade gel visar ett spektrum av förmodad proteiner som interagerar med C-ändstationen av receptorer smält med GST (blå box). Kontroller filer för GST ensam (gul box) och glutation sepharose pärlor ensam visas också. Pilarna visar exempel på unika band som klippts för vidare analys av masspektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jonkanaler är en stor klass av integrerade membranproteiner. De innehåller vattenfyllda porer som selektivt tillåta förflyttning av joner ner sina elektrokemiska gradienter över plasmamembranet. Jonkanaler grind mellan öppna och slutna stater. Det gating steget är utlöses av sändare (t.ex. ATP) vid P2X ligandreglerade jonkanaler, eller det kan regleras av interaktioner med andra proteiner. Det senaste decenniet har bevittnat en ökning av vår förståelse av hur P2X receptorer binder ATP-13, men rollen av kompletterande proteiner i regleringen P2X Funktionen är mindre väl förstådd. Den strategi som beskrivs i detta protokoll är utformad för att identifiera de signalering komplex som bildas av P2X2 receptorer genom att granska (som ett första steg) de proteiner interagerar med intracellulära C-terminal. En komplett karta över P2X2 receptor signalering komplex kommer att ge välbehövlig insikt i patofysiologin vid dessa fascinerande kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
SW och TMV stöds av NCRR och NHLBI vid National Institutes of Health. BSK och HS stöds av NINDS och NIGMS av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Reagent | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Reagent | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagent | VWR international | VW1507-01 | |
| Ammonium Bicarbonate | Reagent | Fluka | 09830 | |
| Ammonium Persulphate (APS) | Reagent | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) | Reagent | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford reagent | Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Dithiotritol (DTT) | Reagent | EMD Millipore | 3860 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Reagent | VWR international | VW1474-01 | |
| Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Formic acid | Reagent | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutathione Sepharose 4B beads | Reagent | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB) Media | Reagent | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Reagent | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Flouride (NaF) | Reagent | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Reagent | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagent | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) | Reagent | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Reagent | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Protein standard | Reagent | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagent | Acros Organics | 61207 | |
| Screw top vial | Tool | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Ruby protein gel stain | Reagent | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Reagent | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Reagent | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Nano Liquid Chromatography System | Tool | Eksigent | ||
| B-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 |
References
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).
- Burnashev, N. Calcium permeability of ligand-gated channels. Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Khakh, B. S., North, R. A. P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease. Nature. 442, 527-532 (2006).
- Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding. J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).
- Khakh, B. S. International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits. Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).
- Young, M. T. Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy. J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).
- Edmondson, R. D. Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS. Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).
- Evans, R. J. Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors. Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).
