Summary
الاشتقاق السلائف ظهاري من الخلايا الجنينية (ES) الجذعية باستخدام خلايا انسجة النشاط يحفز المشتقة (SDIA).
Abstract
ES الخلايا لديها القدرة على التمايز إلى خلايا من كل الطبقات الجرثومية ، مما يجعلها أداة جذابة لتطوير علاجات جديدة. بشكل عام ، والتفريق بين الخلايا وفاق يتبع مفهوم لتوليد first الخلايا الاصلية غير ناضجة ، والتي يمكن بعد ذلك نشر ومتمايزة في الظواهر الخلوية ناضجة. وهذا ينطبق أيضا على تكوين الخلايا العصبية المشتقة من خلية وفاق ، والذي تطور من الخلايا العصبية يلي خطوتين رئيسيتين : الأولى ، والاشتقاق والتوسع السلائف ظهاري غير ناضجة والثانية ، والتمايز في الخلايا العصبية الخاصة ناضجة. ويستند أسلوب مشترك لإنتاج خلايا عصبية من الأسلاف وفاق بشأن تشكيل مضغي الشكل (EB) الجسم ، والذي يكشف عن تمايز الخلايا من جميع الطبقات بما في ذلك جرثومة neuroectoderm. طريقة بديلة وأكثر فعالية لتحفيز نمو الخلايا الظهارية العصبية يستخدم انسجة النشاط يحفز الخلايا المشتقة من (SDIA) ، والذي يمكن تحقيقه من خلال خلايا ES شارك في زراعة نخاع مع عظم الجمجمة المستمدة من الخلايا اللحمية (1). كل من تشكيل المجلس التنفيذي ، وSDIA ، تكشف عن تطوير هياكل شبيهة ريدة ، التي يعتقد أنها تشبه الأنبوب العصبي و / أو العصبية الأسلاف قمة شبيهة. ويمكن عزل السلائف العصبية وتوسيعه وبتقسيمها الى الخلايا العصبية والخلايا الدبقية محددة باستخدام شروط ثقافة محددة. هنا ، نحن تصف الجيل وريدات عزل هذه الثقافة في المشاركة في التجارب مع خط الخلية اللحمية MS5 (2-5).
Protocol
الخطوة 1
- لوحة mitomycin - C - ggrowth تحول دون (10 ميكروغرام / مل لمدة 2.5 ساعة) MS5 الخلايا في كثافة CM2 / 70000 على الجيلاتين المغلفة لوحات 6 (0.01 ٪ لمدة 30 دقيقة) جيدا في α - MEM وسائل الإعلام.
- عندما تعلق الخلايا وشكلت أحادي الطبقة (أكثر من النمو ليلة) ، والتحول إلى SRM.
- عزل المستعمرات الخلية يدويا ES من الثقافات الخلية ES باستخدام المحاقن مع 27 ½ G الإبرة.
- Tritrurate المستعمرات بعناية مع طرف زرقاء 1 مل ومنخفض الكثافة في لوحة على خلايا MS5 (عادة 2-3 المستعمرات في لوحة 6 أيضا).
ملاحظة : يمكن أيضا أن خلايا ES تؤخذ من الانتشار الأنزيمية باستخدام كولاجيناز أو التربسين.
الخطوة 2
- تنمو الخلايا ES على مغذيات MS5 لمدة 14-21 يوما ، الى حين تشكيل المستعمرات التي تحتوي على ريدة.
ملاحظة : تغيير وسائل الإعلام في كثير من الأحيان. وريدات وعادة ما تكون على الحواف الخارجية للمستعمرات ، ويمكن تشكيلها تتعزز بشكل كبير إذا تم إضافة 300-500 نانوغرام / مل رأس لSRM (3). تمايز في بعض البروتوكولات ، ويمكن تبادلها مع SRM A - N2 وسائل الإعلام وتستكمل مع النمو أو العوامل الأخرى لتعزيز مواصفات الخلية (2-5).
الخطوة 3
- عزل وانتقاء ريدات مع 27 تحت المجهر G ½ الإبرة.
ملاحظة : تجنب القطع واختيار الخلايا اللحمية MS5. إذا كانت معبأة المستعمرات مع ريدات ، يمكن للمرء أيضا عزل المستعمرة برمتها.
الخطوة 4
- نضح في مجموعات من ريدات ، tritrurate بعناية مع طرف 1 مل الأزرق ، ومنها على لوحة بولي - L - الأورنيثين (0.001 ٪) وفبرونيكتين (1 ميكروغرام / مل) أو laminin (1 ميكروغرام / مل) المغلفة 6 آبار في N2 - A تستكمل وسائل الاعلام عادة مع bFGF (20 نانوغرام / مل). فإن إصلاح وتوسيع الوريدات.
ملاحظة : تعزيز بقاء الخلية ، ويمكن للمرء أن بليت في مجموعات صغيرة لزيادة الكثافة قطرات الخلية. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذه الخطوة من خلال استكمال N2 - A وسائل الاعلام مع نمو إضافية أو العوامل الأخرى لتعزيز مواصفات الخلية (2-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يوضح الخطوات المختلفة في توليد وعزل الخلايا الظهارية العصبية من الخلايا البشرية وفاق به SDIA. تطبيق هذا الأسلوب متعدد الجوانب واستخدمت في العديد من البروتوكولات لإنتاج خلايا عصبية معينة (مثلا 1 ، 2 ، 5-9). ويعتقد أن ريدات تشبه الخلايا العصبية أنبوب مع النمط الظاهري الأمامي (2 ، 5 ، 10) ، وتحتوي أيضا على قمة الأسلاف العصبية (11 ، 12). بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تحتفظ مستوى معين من المرونة ، حيث يمكن منقوشة من قبل عوامل محددة في ظروف محددة الثقافة. وبالتالي ، يمكن للأسلاف SDIA المستمدة من العصبية تؤدي إلى العديد من أنواع الخلايا العصبية من النظام المركزي والمحيطي وجعلها أداة مفيدة لاشتقاق مجموعات سكانية مختلفة الخلية العصبية في نماذج ES تمايز الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| MEM nonessential amino acid solution | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gelatine type-A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% solution | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 mL Syringe with 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6-well Plates | for tissue culture |
References
- , Forthcoming.
