Summary
Вывод нейроэпителиальных предшественников из эмбриональных стволовых (ЭС) клеток с использованием стромальных клеток-производных вызывающие активность (SDIA).
Abstract
ЭС клетки обладают потенциалом дифференцироваться в клетки всех зародышевых листков, что делает их привлекательным инструментом для разработки новых методов лечения. В общем, дифференцировку ЭС клетки придерживается концепции сначала подготовить незрелых клеток-предшественников, которые затем могут быть распространены и дифференцировались в зрелых клеточных фенотипов. Это относится и к ЭСК полученных нейрогенез, в котором развитие нервных клеток является продолжением двух основных этапов: Во-первых, вывод и расширения незрелых нейроэпителиальных прекурсоров и во-вторых, дифференциация их в зрелые нервные клетки. Распространенным методом для производства нейронных прародителей из ЭС клеток основана на эмбриоидных тела (EB) образование, которое показывает, дифференцировки клеток от всех зародышевых листков в том числе нейроэктодермы. Альтернативный и более эффективный метод, чтобы побудить нейроэпителиальных развития клетка использует стромальных клеток-производных вызывающие активность (SDIA), которая может быть достигнута путем совместного культивирования ЭС клетки и черепа костномозгового происхождения стромальных клеток (1). Оба, Е. Б. формирования и SDIA, показывают развитие розетка-подобных структур, которые, как считается, напоминают нервной трубки и / или нервного гребня, как прародителей. Нейронных прекурсоров может быть изолирован, расширение и дальнейшее дифференцировались в специфических нейронов и глии клеток с использованием определенных условиях культуры. Здесь мы описываем поколения и изоляции таких розетки во взаимодействии культуры эксперименты с стромальных клеточных линий MS5 (2-5).
Protocol
Шаг 1
- Пластина митомицин-С ggrowth-тормозится (10 мкг / мл в течение 2,5 часов) MS5 клеток при плотности 70000 / см2 на желатин покрытием (0,01% в течение 30 минут) 6 луночных планшетах в α-MEM СМИ.
- Когда клетки прикрепляются и образовали монослоя (за одну ночь роста), переключиться на SRM.
- Вручную изолировать колонии ЭСК из ES культурах клеток с помощью шприца с 27 ½ G иглы.
- Tritrurate колонии тщательно с 1 мл синий наконечник и пластины при низкой плотности на MS5 клетки (обычно 2-3 колоний на 6-луночный планшет).
Примечание: ЭС клетки могут быть взяты из ферментативных распространения с применением коллагеназы или трипсина.
Шаг 2
- Расти ЭС клеток на MS5 питателей в течение 14-21 дней, пока розетки содержащих образуют колонии.
Примечание: Изменение СМИ часто. Розетки, как правило, на внешних краях колоний и их образование может быть значительно повышена, если 300-500 нг / мл Ноггин добавляется в SRM (3). В некоторых дифференциация протоколы, SRM можно обменять на N2-медиа и дополнены роста или другие факторы, чтобы способствовать ячейки спецификации (2-5).
Шаг 3
- Изолировать и подобрать розетки с 27 ½ G иглу под микроскопом.
Примечание: Не резки и выбрать MS5 стромальных клеток. Если колонии упакованы с розетками, можно также выделить всю колонию.
Шаг 4
- Аспирируйте кластеров розетки, tritrurate их тщательно с 1 мл синий наконечник, и пластины их на поли-L-орнитин (0,001%) и фибронектина (1 мкг / мл) или ламинин (1 мкг / мл) покрытием 6 скважин в N2-СМИ обычно дополнены bFGF (20 нг / мл). Розетки будут реформировать и расширить.
Примечание: Для повышения выживаемости клеток, можно пластины малых кластеров в каплях увеличить плотность клеток. Этот шаг также может быть изменена путем дополнения N 2-СМИ с дополнительным ростом или другие факторы, чтобы способствовать ячейки спецификации (2-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол демонстрирует различные этапы в создании и изоляции нейроэпителиальных клеток из человеческих клеток ES использованием SDIA. Применение этого метода состоит в многообразии и была использована во многих протоколов для производства указанных нейронов (например, 1, 2, 5-9). Розетки, как полагают, напоминают нервные клетки трубки с передней фенотип (2, 5, 10), а также содержат нейронных прародителей гребне (11, 12). Кроме того, они сохраняют определенный уровень пластичности, так как они могут быть составлены по образцу конкретных факторов в определенных условиях культуры. Таким образом, SDIA полученных нейронных прародителей может дать начало многим типам клеток из центральной и периферической нервной системы делает их полезным инструментом для вывода различных нервных клеточных популяций в парадигмах ES клеточной дифференцировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| MEM nonessential amino acid solution | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gelatine type-A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% solution | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 mL Syringe with 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6-well Plates | for tissue culture |
References
- , Forthcoming.
